*

(1. 浙江大学化学系，杭州 310007；2. 浙江省中医药研究院，杭州 310007)

骨质疏松症是一种以骨量降低、骨组织显微结构破坏、易发生骨折为特征的全身代谢性疾病[1]。中医将骨质疏松归于“骨痛”与“骨痿”等范畴，常以补肾方剂治疗。二仙汤由仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、黄柏及知母六味中药组成[4，5]，是治疗骨质疏松症的名方，对于骨质疏松患者及骨质疏松模型动物的骨密度、骨小梁厚度等指标有改善作用[6，7]，增强体外培养成骨细胞增殖及骨形成能力[8]。目前对二仙汤的研究多集中于药理机制，尚未见到报道考察二仙汤在动物体内血药浓度的研究。

二仙汤的主要成分为仙茅苷、淫羊藿苷、小檗碱、阿魏酸、知母皂苷BII。药理研究显示仙茅苷具有清除氧自由基，增强免疫作用，延缓生殖系统老化，抗骨质疏松，保护心血管系统等作用。淫羊藿苷提取自淫羊藿的干燥茎叶，为淫羊藿的主要有效成分。属黄酮类化合物。体内和体外研究发现，淫羊藿苷具有显著的抗炎、抗氧化、及促进成骨细胞增殖作用[9]。小檗碱是属于异喹啉类生物碱，是中药黄柏的主要生物碱之一。近年来研究发现，小檗碱及其衍生物在治疗炎症、肿瘤、糖尿病、阿尔茨海默病等方面具有药理作用，且可以抑制破骨细胞活性达到抗骨质疏松作用。阿魏酸是从当归中提取出来的有效成分，有镇静镇痛、改善微循环及促进成骨细胞增殖等作用。研究表明[10]，知母皂苷BⅡ能明显降低四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的血糖水平，提高去卵巢大鼠骨密度，发挥抗骨质疏松活性。

超高效液相色谱-三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)法能够从复杂样品中明确目标物，大大提高了生物样品检测的灵敏度和专一性，是目前测定药物成分含量最有效的方法之一。因此本工作采用UPLC-MS/MS方法研究二仙汤含药血清中有效成分的含量，为该方剂的现代化研究提供实验基础。

1 试验部分

1.1 仪器及试剂

Waters Xevo TQD型超高效四极杆质谱，电喷雾(ESI)离子源，Waters ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪；Millipore纯水机；METTLER AE-50天平；Microfuge 20R高速离心机； IKA Lab Dancer多用途涡旋混合器。

对照品：淫羊藿苷(批号：489-32-7)、知母皂苷BII(批号：16041602)、仙茅苷(批号：85643-19-2)、小檗碱(批号：15010411)均购自于北京世纪奥科生物技术有限公司；阿魏酸(批号：110773-200611)由中国药品生物制品检定所提供；HPLC级甲醇和乙腈购自默克(Darmstadt，德国)；水为自制双蒸水，其余试剂均为分析纯；全部溶剂均采用0.22μm微孔滤膜过滤。

1.2 仪器工作条件

(1) 色谱条件：分析柱：ACQUITY UPLC BEH C18；流动相A：水，流动相B：乙腈；线性梯度洗脱，洗脱流程为：0～3min，10%B；8min，25%B；11min，35%B；14min，45%B；17min，55%B；18～28min，95%B；28.2～30min，10%B；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；进样体积：5μL。

(2) 质谱条件：电喷雾电离(ESI+/ESI-)；质谱扫描方式：多反应检测(MRM)；脱溶剂气：氮气；碰撞气：氩气；干燥气流量：10L/min；干燥气温度：350℃；雾化气：35psi；锥孔电压：35℃。其他质谱条件见表1。

表1 质谱条件

1.3 试验方法

(1) 对照品的配制：精密称取淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷、阿魏酸、小檗碱0.5 mg溶于空水，溶解均匀，配制成100 mg/L储备液。精密吸取淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷、阿魏酸、小檗碱储备液适量，配制为系列浓度的工作溶液。储备液与工作液经0.45μm微孔膜过滤，备用。

(2) 二仙汤水提物的制备：分别取9g淫羊藿、9g仙茅、9g巴戟天、9g当归、6g知母、6g黄柏，先双蒸水浸润30min，后热水回流提取40min，反复煎煮3次，最后将3次药液合并，浓缩至成为二仙汤提取液(2g生药/mL)。

(3) 血清样本的制备：取雄性大鼠10只，每组5只，共两组，即空白组、全方组，连续喂养并给药4周，于第四周周末禁食12h(自由饮水)，按照2mg/100g体质量，分别灌胃给予蒸馏水、二仙汤的灌胃药液，给药2h后，用10%水合氯醛麻痹并经肛门静脉取血5mL，血液3000rpm条件下离心10min，取上清液1mL，加入0.6mL6%高氯酸，快速摇匀，3000rpm条件下离心10min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，备以HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 线性范围及最低检测限

精密吸取淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷、阿魏酸、小檗碱储备液适量，取适量空白血清加入，配制为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/L浓度的工作溶液。每一浓度6份，按“1.2项”下UPLC-MS/MS条件进行测定，色谱图如图1所示。以淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷、阿魏酸、小檗碱的浓度X与其峰面积Y作线性回归，得到线性回归方程和相关系数，并以信噪比(S/N)≥3的浓度测得检出限，结果见表2。

表2 指标成分的回归方程、相关系数(r)及检出限

图1 二仙汤5种有效成分的色谱图

2.2 样品含量测定

10只大鼠灌胃给药2h后，进行UPLC-MS/MS分析。结果见表3。其中在血清中发现了淫羊藿苷、知母皂苷BII以仙茅苷，含量范围是在0.19～0.80mg/L。文献报道[11]，阿魏酸和小檗碱的口服吸收较差,生物利用度较低，本工作在大鼠血清中未检出阿魏酸和小檗碱。

表3 大鼠灌胃2h后血清中各化合物浓度

注：ND表示未测得。

3 结论

通过UPLC-MS/MS法测定二仙汤中抗骨质疏松成分，并将其对大鼠口腔灌胃，大鼠血清中检测到淫羊藿苷、知母皂苷BII和仙茅苷，阿魏酸和小檗碱未检出，与化合物在动物体内生物利用度低有关。本研究所建立的超高效液相色谱串联质谱法测定血清中二仙汤抗骨质疏松成分含量测定方法简便、快速、灵敏、准确，能满足临床中药制剂中指标成分在生物样本中含量测定，为中药代谢组学，药动学和药效学研究提供科学的依据。