，，

(甘肃省农业科学院 土壤肥料与节水农业研究所，甘肃 兰州 730070)

0 引 言

蒙古黄芪(AstragalusmembranaceusBge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)为豆科黄芪属多年生植物，根入药，性微温，味甘，是我国中医常用的滋补药材[1]。由于社会对黄芪需求量的不断增加，使黄芪的轮作周期缩短，重茬和迎茬面积增加，黄芪的连作障碍现象日益突出，病害越来越严重，产量开始逐年锐减[2]。国内外的研究表明，造成连作障碍的原因主要有土壤理化性质恶化、土壤生物学环境恶化以及自毒作用等[3-5]。有学者从蚕豆、大蒜及地黄等作物的根系分泌物中分离出化感自毒物质，并发现根系分泌物的逐年累积将会对作物生长产生越来越大的影响[6-8]。自毒作用是由植物茎、叶及凋落物的淋溶、植株残体的腐解以及根系分泌物等释放出的物质，对同茬或下茬同种植物的生长和发育产生抑制作用[9]。由于幼苗期的植物通常比较脆弱，容易受到自毒物质的影响，所以植物的自毒作用一般发生在幼苗阶段[10]。相对于普通作物，药用植物自毒作用更强[11]。已有学者对三七、人参、地黄、苍耳及当归等药用植物的化感自毒作用进行了研究[12-15]，但关于黄芪根系分泌物对其种子和幼苗的自毒作用报道较少。因此，本研究采用水培法收集蒙古黄芪根系分泌物，尽可能排除外界环境的干扰，研究蒙古黄芪根系分泌物对其种子萌发和幼苗生长的自毒效应，以期揭示根系分泌物在蒙古黄芪连作障碍中的作用机制，并为蒙古黄芪的科学种植及可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蒙古黄芪种子2016年10月购自陇西县中药材市场，为健康、饱满、无病虫害、无霉变当年产的蒙古黄芪种子。

1.2 试验方法

1.2.1 采用水培法收集黄芪的根系分泌物。选取大小均匀、饱满、无虫子的种子，用浓硫酸浸泡5 min，取出种子并用蒸馏水冲洗干净，将蒙古黄芪种子播于含有石英砂(高温高压灭菌，70 ℃烘干)的育苗盘，待蒙古黄芪根长到8～10 cm时，拔出蒙古黄芪幼苗。拔苗前向育苗盘中加入过量蒸馏水，使基质湿润，尽可能不要弄伤幼苗根系。将拔出的幼苗用蒸馏水洗干净，定植于均匀打孔的泡沫板上，移入蒙古黄芪水培培养箱(高20 cm，长30 cm，宽20 cm)。培养箱中加入1L改良Hoagland 营养液[16]，将蒙古黄芪幼苗悬浮于营养液上进行培养。每个培养箱种植蒙古黄芪25株，共种植8箱。每5 d更换一次营养液，每天通气和光照12 h(7:30-19:30)。移栽30 d 后，开始收集蒙古黄芪根系分泌物，具体收集方法为[17]：光照3 h后，将每个培养箱中的蒙古黄芪植株取出，用去离子水将根系冲洗5次，尽量不要伤到根。洗完后将蒙古黄芪移入装有1L 去离子水的水培培养箱中，收集分泌物12 h。用遮光布将水培培养箱的四周包裹，保证蒙古黄芪根部处于避光条件。将收集的根系分泌物合并后过0.45 μm的微孔滤膜(采购自上海新亚净化器件厂)，滤液在50 ℃条件下真空浓缩至50 mL，得到200株蒙古黄芪根系分泌物的浓缩液，即每0.4 mL蒙古黄芪根系分泌物浓缩液相当于单株蒙古黄芪12 h的根系分泌量。隔3 d收集浓缩一次根系分泌物，共收集4次，最后共得到200 mL蒙古黄芪根系分泌物浓缩液，贮于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 根系分泌物对种子萌发的化感自毒效应测定。以不同浓度蒙古黄芪根系分泌物溶液对其种子进行处理，共设对照(CK)无提取液、提取液稀释0.8倍、提取液稀释0.6倍、提取液稀释0.4倍、提取液稀释0.2倍和提取液未稀释6个处理。取5 mL不同浓度的根系分泌物溶液加入铺有2 层定性滤纸的培养皿中进行种子发芽试验，每皿放大小均匀的蒙古黄芪种子20粒，每个处理放5皿，共100粒种子。将放好种子的培养皿移入到30 ℃的恒温培养箱中培养，每天观察并记录发芽数，补充1 mL蒸馏水。发芽势和发芽指数在种子培养第7 d时统计，发芽率在种子培养第14 d时统计，种子芽长是种子长度的一半为发芽标准。计算公式如下[18]。

发芽率(%)=(发芽14 d后正常发芽的种子数/供试种子数)×100%

(1)

发芽势(%)=(7 d内发芽种子数/供试种子数)×100%

(2)

发芽指数=Σ(Gt/Dt)

(3)

式中：Gt为培养第t天的发芽种子数；Dt为相应的培养天数。

1.2.3 根系分泌物对幼苗生长的化感自毒效应测定。种子培养14 d时，测定蒙古黄芪幼苗的胚芽长、胚根长、幼苗鲜重。将所有幼苗的胚根、胚芽从种子结合部切下后测定其长度，并计算平均值。

幼苗活力指数=Gi×S

(4)

式中：Gi代表发芽指数；S代表培养结束时的胚芽长度与胚根长度之和[19]。

1.2.4 蒙古黄芪根系分泌物的化感效应通过化感效应值(RI)评价[20]。若T≥C，则RI=1-C/T；若T0，则表示根系分泌物对受体作物有促进作用；如果化感效应值(RI)<0，则表示根系分泌物对受体作物有抑制作用；绝对值越大，化感作用越强。如果某一指标与化感效应值呈负相关关系，则化感促进或抑制作用相反。根系分泌物的综合化感效应评价，通过计算各指标的化感效应值累加值大小确定[18]。

1.2.5 幼苗保护酶活性及丙二醛(MDA)含量测定。

待测酶液的提取：称取0.2 g蒙古黄芪幼苗放入冷却的研钵中，加入5 mL磷酸缓冲液(pH 7.8，0.05 mol·L-1)研磨成匀浆，移入5 mL离心管，在4 ℃条件下，4 000 r·min-1离心10 min，将上清液移入10 mL容量瓶并定容，放入冰箱备用。

幼苗保护酶活性测定：超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法(NBT)[21]测定。取待测酶液30 μL加入10 mL刻度试管，然后依次加入甲硫氨酸溶液(30 mmol·L-1)、氮蓝四唑溶液(750 μmol·L-1)、乙二胺四乙酸溶液(1 mmol·L-1)和核黄素(20 μmol·L-1)各0.3 mL，再依次加入0.27 mL蒸馏水和1.5 mL磷酸缓冲液(pH值7.8、0.05 mol·L-1)，混匀后将1支对照管置于暗处，测定管在4 000 lx日光灯下反应20 min，对照调零，560 nm下测定OD值。以抑制NBT光化还原的50%为1个SOD活力单位(U)，以每克酶制剂所具有的酶活力单位数(U·g-1)表示SOD活性大小。过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法测定[22]，取0.2 mL待测酶液加入比色管，然后加入2.8 mL H2O2(0.067 mol·L-1)启动反应，在240 nm下测OD值，每1 min读OD值1次，读3 min。以1 min内OD240 nm减少0.1的酶量为1个酶活力单位(U)。过氧化物酶(POD)采用愈创木酚比色法[23]测定。取1 mL待测酶液加入刻度试管，然后加入3 mL反应混合液，反应混合液由100 mL 0.05 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH 6)，56 μL愈创木酚和38 μL 30%的过氧化氢配置而成，摇匀后，在470 nm下测定OD值，以每1 min内OD470nm值变化0.01为1个酶活性单位(U)。

丙二醛(MDA)含量参照林植芳等[24]的方法测定。称取0.5 g幼苗放入研钵内，依次加入3 mL冷却的磷酸缓冲液(pH 7.8、0.05 mol·L-1)和少量石英砂，在冰浴中研磨成匀浆，然后将匀浆移入5 mL的离心管，并用磷酸缓冲液定容至5 mL，5 000 r·min-1离心10 min，保留上清液备用。取2 mL上清液于10 mL刻度试管中，加入3 mL 5%三氯乙酸溶液(含0.5%硫代巴比妥酸)，沸水浴10 min，冷却后5 000 r·min-1离心10 min。取上清液分别在600 nm、532 nm和450 nm下测OD值。

1.3 数据统计分析

应用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行统计，采用Duncan法进行数据间的多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 根系分泌物对种子萌发的化感自毒作用

蒙古黄芪根系分泌物对种子萌发的化感自毒效应，见表1。种子的发芽率、发芽势和发芽指数随根系分泌物浓度的升高而降低，除根系分泌物提取物稀释0.8倍的处理外，其余稀释0.6倍、稀释0.4倍、稀释0.2倍和未稀释处理的种子发芽率、发芽势和发芽指数均显著低于对照(P<0.05)，但稀释0.4倍和稀释0.6倍处理之间，稀释0.2倍和未稀释处理之间无显著差异。与对照相比，根系分泌物提取原液处理的发芽率、发芽势和发芽指数分别显著降低了43.6%、34.0%和59.6%(P<0.05)。

蒙古黄芪根系分泌物对种子萌发的化感效应评价，见表2，除稀释0.8倍处理外，其它处理发芽率和发芽指数的化感效应绝对值均大于发芽势的化感效应值绝对值；随着根系分泌物浓度的升高，化感效应绝对值逐渐增大，化感效应绝对逐渐增强。

表1 根系分泌物对种子萌发的化感自毒效应Table 1 Effects of Astragalus membranaceus root exudates on allelopathic autotoxicity of seed germination

注：同列不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。

Note：Different letters in the same column indicate significant differentes among treatments at 0.05 level.The same is as below.

表2 根系分泌物对种子萌发的化感效应评价Table 2 Evaluation for effects of Astragalus membranaceus root exudates on allelopathic autotoxicity of seed germination

2.2 对幼苗的化感自毒效应

不同浓度的蒙古黄芪根系分泌物对幼苗的化感自毒效应不同(表3)。化感自毒效应随根系分泌物浓度的升高逐渐增强。根系分泌物提取物稀释0.8倍处理对幼苗的生长基本没有影响。与对照相比，稀释倍数小于0.6的根系分泌物提取液处理显著抑制蒙古黄芪幼苗的生长(P<0.05)，表现为降低幼苗鲜重，抑制胚根、胚芽生长，化感自毒效应随根系分泌物浓度的增加而逐渐增强。

不同测定指标间比较，蒙古黄芪根系分泌物对胚根长度、幼苗活力指数及苗鲜重的化感效应值绝对值较大；幼苗胚根长度、胚芽长度、苗鲜重和幼苗活力指数的化感效应值累加值，随根系分泌物浓度的增大而逐渐升高，变化趋势与化感效应值一致(表4)。

表3 根系分泌物对幼苗生长的化感自毒效应Table 3 Effects of Astragalus membranaceus root exudates on allelopathic autotoxicity of seedling growth

表4 根系分泌物对幼苗生长化感效应综合评价Table 4 Evaluation for effects of Astragalus membranaceus root exudates on allelopathic autotoxicity of seedling growth

2.3 根系分泌物对幼苗抗氧化酶活性及膜脂过氧化的影响

未稀释根系分泌物提取液处理的SOD活性、POD活性和CAT活性分别为64 U·g-1、7.0 U·g-1·min-1、21.0 U·g-1·min-1，与对照比较，SOD、POD和CAT活性分别显著降低了24.9%、22.0%和35.0%(P<0.05)(表5)，差异达到显著水平，说明高浓度的根系分泌物抑制了黄芪幼苗的SOD 、POD和CAT的活性，影响幼苗的生长。稀释0.8倍处理的CAT和MDA含量与对照比，差异均不显著。稀释浓度大于0.6倍的处理，MDA含量显著高于与对照(P<0.05)，由此可见，较低浓度的根系分泌物对自身幼苗细胞膜系统没有伤害，而稀释倍数小于0.6的根系分泌物则对自身幼苗细胞膜系统造成一定伤害，影响幼苗的生长。

表5 根系分泌物对幼苗抗氧化酶活性和MDA含量的影响Table 5 Effects of root exudates on SOD,POD,CAT activities and MDA content in seedlings of Astragalus membranaceus

3 讨 论

研究植物根系分泌物的化感作用时，必须排除土壤理化反应、土壤微生物以及土壤原生动物分解代谢作用的影响[25]。水培收集法是目前学者们常用的植物根系分泌物收集方法之一[26]，其优点是操作简单，并尽可能排除了外界环境的影响，最大限度地反映了根系分泌物的本质[27]。研究根系分泌物对植物种子萌发及幼苗生长的促进或抑制作用，可以直观反应根系分泌物对植物早期生长的化感自毒效应[28]。

蒙古黄芪是根类药材，其根系分泌物在土壤中的积累使其较易发生土传病害，研究表明蒙古黄芪根际土提取物对其种子萌发和生长均存在一定的自毒作用[19]。本研究通过种子萌发及幼苗生长实验评价蒙古黄芪根系分泌物的化感自毒效应。结果发现，不同浓度的根系分泌物对种子的发芽率、发芽势和发芽指数，幼苗的胚根长度、胚芽长度和幼苗活力指数的化感自毒效应不同。化感综合效应随蒙古黄芪根系分泌物浓度的升高呈现出逐渐增加的趋势。蒙古黄芪根系分泌物对其种子萌发和幼苗生长的抑制作用随根系分泌物浓度的增大而加强，低浓度的根系分泌物对种子萌发和幼苗生长基本没有抑制作用。这与刘素慧等[29]、李忠等[30]研究大葱、洋葱、韭菜以及花生上的根系分泌物对作物的影响获得的结果一致。张磊等[31]研究不同浓度大蒜根系分泌物对当归种子萌发及幼苗生长的影响发现，低浓度的根系分泌物可以促进当归幼苗叶片糖分积累，提高当归种子的发芽率，增强幼苗的抗逆性，而高浓度则会抑制幼苗的生长。

作物自身的保护酶SOD和POD 可减轻活性氧对作物的伤害，保护作物细胞膜结构，抵抗逆境胁迫的危害。有研究表明根系分泌物对作物细胞的保护酶系统具有一定的损害作用，使作物细胞内活性氧动态失衡，破坏细胞膜的稳定结构[32]。本试验结果表明，高于40%的根系分泌物处理，SOD、POD 和CAT酶的活性随着根系分泌处理浓度的增加而降低， MDA含量随着根系分泌处理浓度的增加而增加，这与王闯等[33]研究黄瓜根系分泌物对黄瓜幼苗生长和生理特性的影响获得的结果一致。根系分泌物是土壤中化感物质和自毒物质的主要来源之一，是影响植物连作的重要障碍因子[34]。

本研究仅通过比较不同浓度根系分泌物对蒙古黄芪种子萌发和幼苗生长的化感自毒效应，确定根系分泌物对蒙古黄芪早期生长的影响作用。要明确根系分泌物对蒙古黄芪生长的化感自毒效应，还需要研究根系分泌物对蒙古黄芪后期生长的影响作用。总之，在蒙古黄芪的种植中，不仅要利用根系分泌物对其它作物的促进作用合理安排轮作，缓解其它作物的连作障碍，而且还需要避免自身的连作以及与同属作物的轮作，最大限度减轻根系分泌物的化感自毒效应。

4 结 论

蒙古黄芪根系分泌物对其种子的萌发和幼苗生长的抑制作用随根系分泌物浓度的增大而增加。高于40%的根系分泌物处理的SOD、POD 和CAT酶的活性随根系分泌处理浓度的增加而降低，MDA含量随根系分泌处理浓度的增加而增加，可以推断，根系分泌物抑制了蒙古黄芪幼苗保护酶SOD、POD和CAT的活性，影响了幼苗的生长。