戴舒雅， 周阳， 施海峰， 顾杰

(江苏大学 生命科学研究院， 镇江 212013)

镉作为环境中普遍存在的重金属污染物，可通过多种途径进入人体。长期镉暴露导致体内的镉含量积累，破坏肝、肾等器官的结构和功能，对机体的生殖、免疫和神经等系统造成不同程度的损伤[1]。现有的研究结果揭示镉的生物学毒性机制主要是由镉诱导内氧化应激，增加氧化压力，损伤DNA，促进细胞凋亡[2]。目前，自噬也被认为是镉生物学毒性的重要机制之一。

自噬是真核细胞内一种进化保守的自我消化机制，是负责将受损的细胞器、错误折叠的蛋白及其他大分子物质等运送至溶酶体降解并再利用的过程。在哺乳动物细胞中，根据细胞质物质到达溶酶体的途径不同，自噬可分为3种类型：微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)及分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)。一般情况下自噬是细胞的一种自我保护机制，是调节细胞代谢、维持细胞稳态的主要途径之一。自噬效应的发生取决于自噬流过程是否完成。自噬流，即自噬的完整动态过程，包括自噬体形成、自噬体与溶酶体融合及后续内含物的降解和回收[7]。LC3-II是研究细胞自噬的一个重要标志物，LC3-II的形成与自噬的发生有关，但磷脂酰乙醇胺修饰的LC3-II水平升高只是反应自噬信号的发生。而溶酶体与自噬体的融合及降解(p62蛋白降解)是自噬流完成的关键步骤，是最终决定自噬效应的标志[8]。因此，对自噬的研究有必要结合LC3-II的形成和P62蛋白变化情况。

研究表明，镉处理WI38(肺上皮成纤维细胞)、WLR38可诱导细胞自噬、抑制细胞凋亡从而缓解镉引起的毒性损伤[9]。也有研究认为，在MES-13、NEK-52E(大鼠肾小管上皮细胞)、PC-12(肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)中，镉可诱导细胞自噬性死亡。综上表明，镉诱导的自噬在不同遗传背景的细胞会产生不同的生理效应。Ca2+作为一个多功能的信使分子，它能够调控多种细胞功能，包括增殖、分化、迁移和细胞死亡，自噬体以Ca2+敏感的方式参与并与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，是细胞自噬效应中一个重要的调节物质[14]。但Ca2+在镉诱导的自噬过程中的作用目前尚不明确。因此，本文概述当前镉与自噬关系的研究现状，以及钙在自噬中的作用，探究镉诱导不同细胞的自噬效应机制及与钙离子作用的内在联系。

1 镉诱导和抑制自噬调控细胞存活

许多关于镉诱导细胞凋亡的研究中，都表明自噬是细胞存活和凋亡的关键点。Hitomi研究发现镉处理RMC(大鼠肾小球系膜细胞)可诱导ATG16基因的表达，促进细胞自噬，并维持了细胞的生存能力，而沉默该基因后，则增加了镉引起的细胞凋亡[15]。在PC-12细胞中，镉诱导ROS产生，通过引发自噬抑制了细胞的凋亡[16]。在NRK52E肾脏细胞中，镉诱导细胞凋亡，同时引发自噬信号及自噬流完成，自噬抑制剂CQ与镉共处理，则加重了细胞的凋亡[8]。上述研究认为在镉暴露条件下，自噬是细胞应激适应和保护机制。然而，也有研究认为镉激活自噬也是诱导细胞死亡的原因。Son认为，镉经ROS-LKB1-AMPK信号途径诱导的自噬是导致小鼠表皮细胞JB6细胞毒性的主要原因[17]。Gu发现，在肾小球系膜细胞中，镉通过ROS-GSK-3β和Ca2+-ERK自噬途径诱导细胞自噬性死亡，导致肾毒性[9]。

Meng等人探究镉诱导WRL-68细胞自噬的机制中发现，镉诱导自噬，激活溶酶体功能依赖于自噬小体与溶酶体的融合。镉与自噬的抑制剂共处理，自噬流被抑制，溶酶体活性明显降低。结果表明镉不仅可以促进WRL-68细胞的自噬，还能通过激活溶酶体功能刺激自噬的成熟和降解[18]。Lee等人认为镉可干扰自噬的不同阶段，破坏肾近端小管细胞的自噬作用[12]。在Liu等人对镉诱导细胞(rPT)凋亡与自噬的研究中发现，镉暴露导致原代大鼠近端肾小管上皮细胞(rPT)和小鼠肾小管上皮细胞(mRTEC)中LC3-II和P62蛋白的累积，促进内质网钙离子释放，抑制了自噬体与溶酶体的融合，阻断自噬流，抑制了自噬，促进细胞凋亡[19-20]。上述结果表明，在不同遗传背景细胞中，镉诱导的细胞自噬抑制或促进死亡。而在一些细胞中镉抑制自噬体与溶酶体的融合，导致自噬流阻断,从而促进细胞凋亡。

2 镉对溶酶体的影响

溶酶体作为细胞内重要的“消化”器官，其腔内是一个酸性环境，pH约为4.5～5.0，低于细胞溶质(pH 7.2)，这也是溶酶体发挥功能的重要因素之一。溶酶体内腔包含多种离子通道来维持溶酶体内部的酸性环境，如H+对保持溶酶体酸性水解酶活性起重要作用；钙离子负责囊泡转移；K+调节溶酶体膜电位和溶酶体内Ca2+平衡；Cl-作为阴离子调节溶酶体膜电位[21-22]。已有研究发现，镉处理WRL-68细胞，增强了细胞溶酶体的酸性，促进了自噬[18]。镉处理Neuro-2a细胞后，Cd抑制该细胞自噬体-溶酶体融合，降低溶酶体功能及溶酶体相关膜蛋白，抑制溶酶体蛋白水解，改变溶酶体pH，导致自噬清除缺陷并导致细胞死亡。Cd诱导TFEB核转位及TFEB靶基因的表达，与溶酶体功能受损、损害自噬流密切相关。而通过TFEB过表达，则恢复了溶酶体相关膜蛋白的表达水平和溶酶体pH，抵抗了镉诱导的毒性[23]。综上表明，镉在不同细胞中引起不同的自噬效应，其内在的机制可能是镉对各细胞内溶酶体酸性及与自噬小体融合的影响不同，进而影响溶酶体功能的发挥。

3 钙离子在镉影响自噬中的作用

3.1 钙与自噬

自噬主要在内质网(ER)的表面触发自噬膜的形成，通过细胞骨架相关的运动，自噬体以Ca2+敏感的方式参与，并与溶酶体融合，形成自噬溶酶体[24]。参与调控自噬的mTOR信号通路和Beclin-1/Bcl-2通路都被认为与各种Ca2+信号通路相互作用[25]。实验证实胞质Ca2+信号可激活自噬，Ca2+来源途径以及许多下游效应分子被认为参与其中[26]，如Ca2+/钙调素激酶激酶(CaMKkKβ或CaMKKβ)是AMPK的上游激活剂，它可以通过抑制mTORC1来诱导自噬[27]；AMPK可以绕过对mTORC1的抑制，而通过磷酸化自噬启动ATG1激酶ULK1来刺激自噬[28]；Ca2+介导的Calpain激活被认为是自噬流的一个关键抑制因子[3]。细胞质Ca2+浓度升高会刺激自噬作用，而Ca2+螯合剂BAPTA处理细胞不仅可抑制自噬作用，还可以激发细胞内的Ca2+信号，同时也能对饥饿、氨基酸降解和mTOR抑制做出反应[29]。在脂毒性作用下，肝细胞内钙离子慢性升高则抑制自噬体与溶酶体之间的融合，从而减弱自噬流，而该现象可被TG(钙ATP酶抑制剂)逆转[30]。

溶酶体被认为是细胞内重要的Ca2+库，细胞Ca2+库与溶酶体蛋白降解之间存在依赖关系。细胞内Ca2+信号通路是调节细胞溶酶体酸性的重要途径之一。Ca2+水平异常会改变溶酶体的酸性，影响溶酶体与自噬体、晚期胞内体及其他细胞器之间的膜融合，影响细胞自噬的发生[31]。在对溶酶体上阳离子交换通道TRPML1的研究发现，Ca2+可经TRPML1从溶酶体中释放。TRPML1的过表达增加自噬，而沉默TRPLM1则降低了HeLa细胞的自噬水平[32]。也有研究认为溶酶体上CACNA1A钙离子通道活性是溶酶体融合以及细胞自噬所必须的，溶酶体腔内的钙离子也可通过其电压门控通道(VGCC)释放到胞质中，促进SNARE蛋白介导溶酶体与内涵体和自噬体的融合[33]。

3.2 镉对钙离子及自噬的影响

Ca2+和ROS是参与调控细胞功能的最具影响力的细胞内信号分子。胞质钙离子过载产生细胞氧化应激，也是损害细胞功能的重要原因。很多研究者在不同细胞中证实，镉的细胞毒性都涉及了胞质Ca2+过载和氧化应激，并共同决定细胞功能和命运。镉诱导胞内钙离子升高，产生氧化压力、阻断了rPT细胞中溶酶体的自噬体融合，导致自噬小体的累积。BAPTA处理后显著逆转了镉诱导的LC3-II和p62蛋白的积累。ROS清除剂NAC处理则可以显著缓解镉对自噬流的抑制[20]。Wang等人研究证实，镉通过PLC-IP3途径介导ER-Ca2+释放的增加，导致mRTEC细胞内Ca2+水平上升，产生ROS。同时也显著增加了LC3-II和p62蛋白的积累，抑制自噬流发生，引起细胞凋亡。ROS清除剂TCP与镉共处理，则缓解了镉对该细胞的毒性作用。镉通过内质网上IP3R通道释放钙离子,提升胞内钙离子水平，并主要经Ca2+-ERK途径介导MES-13细胞自噬[34]。综上表明，镉可以通过PLC-IP3R通路改变细胞内Ca2+浓度，影响细胞溶酶体与自噬体的融合，并产生ROS，进一步影响细胞自噬的发生；也说明了镉诱导细胞自噬与细胞内Ca2+浓度异常、氧化应激之间存在着密切关系。

4 结论与展望

镉作为具有很强生物毒性的重金属，长期镉暴露会对人体多个组织和器官造成损伤。镉对细胞自噬的干扰结果取决于细胞的遗传背景。镉可以通过改变细胞溶酶体的酸性诱导或抑制细胞自噬，影响细胞凋亡；钙作为调节溶酶体功能和细胞自噬的主要途径，在细胞自噬发生的过程中起着重要作用。镉引起的细胞自噬效应与细胞内钙离子浓度存在着紧密联系，干扰溶酶体生理酸性环境，从而影响细胞的自噬过程。因此，进一步阐明镉诱导细胞自噬效应与细胞内钙离子浓度之间的关系，对研究镉生物毒性有着重要的意义。