宾蕾，邓仲良，毕玉晶，杨瑞馥

1.军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，北京100071；2.南华大学公共卫生学院，湖南衡阳417000

肠道微生物群是指定植在人体消化道内的微生物，它的数量多、种类复杂，由细菌、真菌、病毒和原生生物构成。由于其中的细菌研究最为广泛，因此，肠道微生物群又习惯地被称为肠道菌群。正常成人的肠道菌群总重量为1～2 kg，数量至少达1014个，是人体细胞的1～10 倍，包含的基因数量是人类基因数量的150 倍[1]。众所周知，肠道菌群不仅协助宿主消化食物及提供营养成分，还对宿主的健康有着深远的影响。正常肠道菌群对宿主很多重要生理功能的维护和发挥起着非常重要的作用，一旦肠道菌群的正常稳态遭到破坏，即生态失调，就会引发多种疾病。许多研究表明，肠道菌群在我们的生长、发育、代谢等各个方面都发挥着重要作用[2-6]。因此，可以通过调节肠道菌群的结构来实现改善人体健康状态的目标。

近年来发现许多疾病的发生与肠道菌群紊乱有着密不可分的关系，例如，肠道炎症、肥胖、糖尿病等代谢综合征往往伴随着肠道菌群生态失调[7]，研究表明肠道微生物在宿主代谢和低度炎症的调节中起重要作用[8-10]。以肠道原籍菌为基础研发而成的益生菌有望成为许多疾病的治疗新方式。但目前市场上销售的大多数益生菌主要包括乳杆菌和双歧杆菌[11]，它们分别来自厚壁菌门和放线菌门，是至今研发最为成熟的肠道益生菌。除此之外，研究发现在已鉴定的下一代有益微生物中，人类肠道菌群中的嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，AKK）是一种非常有前景的候选细菌[12]。AKK 是从人体粪便中分离培养的一株严格厌氧的肠道菌，与机体能量代谢、免疫应答以及肠道黏蛋白的分泌密切相关，其代谢特性以及影响宿主健康的调控机制是近年来的一大研究热点。

1 嗜黏蛋白阿克曼菌

AKK 的研究历史并不长，它于2004 年被荷兰瓦赫宁根大学微生物实验室的科研工作者通过厌氧培养从人体粪便中分离、鉴定并命名，是一种革兰阴性严格厌氧的肠道细菌[13]。

AKK 隶属疣微菌门（Verrucomicrobia），阿克曼菌科（Akkermansiaceae），阿克曼菌属（Akkermansia）。这个属是该科的惟一成员，是疣微菌门中的优势菌群，约占83%。阿克曼菌属也是在人肠道中发现疣微菌门中的惟一属。与该属16S rRNA 基因高度相关的序列广泛存在于脊椎动物（如人、兔、小鼠和蟒蛇等）的肠道内。对人粪便或活组织样品测序发现，有8 条16S rRNA 基因序列与阿克曼菌属序列相似性水平≥98%，有3 条序列与AKK 的16S rRNA 基因序列相似性＜98%，提示它们可能代表阿克曼菌属的其他种，称为AKK 样菌[14]。但目前阿克曼菌属仅有从人粪便分离的AKK 和从网状蟒蛇粪便中分离的嗜多糖阿克曼菌（A.glycaniphila）2 种[15]，且AKK 是疣微菌门中第一个被成功分离和鉴定的肠道菌种[16]。

2 AKK 在人体中的定植情况

2.1 AKK 主要定植部位

AKK 样菌存在于母乳中和消化道的不同解剖部位如口腔、胰腺、胆系统、小肠、阑尾和大肠中[17]。此外，在败血症和肝硬化患者血液中也检测到AKK 样菌的序列，并从败血症患者血液中分离得到了AKK[18-20]。但定植在这些部位的AKK，其功能可能与定植在结肠黏液层的AKK 不同。整个消化道都存在AKK 样菌，表明该菌可能具有更多的功能尚未发现。在此，我们主要关注AKK定植最为丰富的肠道部位。

肠上皮细胞覆盖着黏液层，该黏液层一方面能吸收营养物质，为微生物提供生长能源；另一方面还可保护肠上皮细胞抵御有毒物质和病原菌的侵袭，是机体重要的保护屏障[21-25]。黏液层中黏液的主要成分为黏蛋白，AKK 有着降解黏蛋白的特性，因此它主要定植在黏液层，丰度通常占肠道微生物群的1%～3%。

2.2 AKK 在健康人群的定植差异

AKK 存在于人体肠道中，人类整个生命的不同阶段都有AKK[26-27]。2007 年，Collado 等根据AKK 的16S rRNA 基因序列可变区设计了特异性引物AM1 和AM2，并验证了该引物对在60℃复性时是AKK 特异的，扩增产物大小为327 bp。研究人员通过16S rRNA 荧光原位杂交（FISH）和实时定量PCR（qPCR）对欧洲不同年龄段的健康受试者粪便样本进行分析，证明AKK 广泛存在于人肠道中，平均定植率约为74.70%。在儿童早期AKK就在肠道内定植（检测到粪便中AKK 浓度为102～104CFU/g），并在一年内就接近健康成人（AKK 浓度为105～108CFU/g）水平，而老年受试者粪便中的AKK 含量比成人低[26]。在芬兰、德国和马拉维等国家[28-30]，婴儿肠道中存在AKK 或疣微菌门细菌。因此，婴儿肠道中AKK 的存在被认为是肠道微生物群发育和多样性的标志。但上述研究结果并不完全适用于不同国家的人群，如中国南方人群中AKK 定植率约为51.74%，远低于欧洲人群，而老年人粪便中AKK 数量却比年轻人高[31]。此外，Kong 等通过对16S rRNA 基因V4-V5 区测序，研究168 位来自中国四川都江堰和雅安的人（67 位长寿老人，54 位老年人，47 位年轻人）的粪便菌群，发现长寿老人菌群的多样性更高，健康的衰老状态与肠道菌群有关，尤其是在长寿老人粪便中梭菌属XIVa、瘤胃菌科、AKK 及Christensenellaceae 科的相对丰度均较高[32]；另一项研究也发现百岁老人或人瑞（年龄为105 岁以上）的粪便中AKK 具有更高的浓度，因此，该细菌被认为在长寿人群的免疫和代谢健康中发挥重要作用，也可能成为健康衰老的生物标志物之一[33-34]。考虑到地域不同、人群居住环境和饮食结构差异对菌群定植的影响，还需要进一步对年龄与AKK的相关性进行分析。

2.3 AKK 的定植与疾病的关系

许多研究表明AKK 的存在与人体健康相关。多数疾病状态下，AKK 的丰度明显低于健康人群，呈负相关。例如，与健康人群相比，AKK 在炎症性肠病（IBD）患者中的丰度降低[35-36]；急性阑尾炎患者体内AKK 数量减少，且其丰度与阑尾炎的严重程度成反比[37]。此外，AKK 的丰度也与盲肠炎、青少年自闭症[35,38]等疾病呈负相关性。

目前关于AKK 与代谢疾病关系的研究颇多。肥胖儿童中AKK 数量显著减少[39]，且有研究证实通过AKK 的定植可以减少体内脂肪堆积，有利于降低体重[40]。因此，AKK 可作为潜在的肥胖判定指标。此外，在糖尿病前期和Ⅱ型糖尿病期间，疣微菌纲的丰度显著降低[41]。AKK 与Ⅱ型糖尿病的几项生化指标也显示出负相关[42]。最近，Hänninen 等发现[43]，在发病率较高的Ⅰ型糖尿病小鼠模型中，肠道菌群中缺少AKK。这与其他研究是一致的，即在人体及小鼠中，肠道菌群中AKK 的丰度与Ⅰ型糖尿病呈负相关，提示AKK 在Ⅰ型糖尿病中起保护作用。研究者提出AKK 的保护机制可能是促进黏液产生以使黏液层增厚，通过促进Foxp3+Treg 细胞、IL-10、TGF-β的增加以减少胰岛炎症[43-44]。早期研究证明通过给小鼠灌胃AKK 可以防止肥胖和相关并发症的发生[40,45]。高脂饮食小鼠中AKK 在体内定植是降低的，而在饮食中添加AKK 可使体重、空腹血糖、胰岛素抵抗及内毒血症恢复正常。值得注意的是这些疾病常伴有肠道功能紊乱和肠道屏障完整性受损，因此，肠道黏液减少进而导致AKK 的定植减少；而肠道通透性增加导致肠道的内毒素进入机体，血浆脂多糖水平升高或细菌移位，从而引起炎症和代谢紊乱等病理状况。因此，后续研究须进一步考虑微生物群与黏液层完整性的关系。

酒精性肝炎（ASH）患者粪便中的AKK 丰度同样低于健康人，间接表明AKK 与肝脏疾病的严重程度相关。同样地，通过酒精灌胃野生型小鼠可显著降低AKK 的丰度，而口服AKK 可恢复酒精导致该菌的减少。研究表明，AKK 可预防性减少肝损伤、脂肪肝和中性粒细胞浸润，防止酒精诱导的肠漏，增加肠道黏液层厚度和紧密连接蛋白的表达，还可治疗性改善酒精性肝病（ALD）患者的肝损伤和中性粒细胞浸润[46]。

2017 年Science发表的一篇关于AKK 的报道使其受到更多的关注，来自法国Gustave Roussy癌症研究所的Zitvogel 教授带领她的团队给出了非常轰动的结果：AKK 在增加癌症免疫治疗效果方面有非常显著的作用。研究人员对249 名接受免疫抑制剂治疗的癌症患者进行观察，其中69 名在使用免疫抑制剂的同时还接受了广谱抗生素治疗。经观察发现，在接受抗生素治疗的患者群体中，癌症复发概率更高，并且接受治疗后存活时间短，平均总生存期为11.5 个月，远远低于未接受抗生素治疗患者的20.6 个月。而在研究过程中，发现免疫治疗效果好的患者体内，其肠道菌群更丰富，尤其是AKK 的存在使患者免疫治疗效果更好。为验证这种相关性，研究人员将具有良好免疫治疗效果患者的粪便移植到无菌小鼠体内，发现免疫效果高于那些未经移植的小鼠；对无免疫反应的无菌小鼠给予口服AKK，再用免疫抑制剂来治疗，发现免疫得到恢复，小鼠体内的肿瘤几乎完全消失[47-48]。这一研究首次证明了AKK 在免疫反应中的作用，说明肠道微生物在免疫治疗中同样发挥重要作用。

上述研究均表明AKK 与健康状态密切相关，AKK 可能作为某些疾病的生物标志物，也可能成为一种极具前景的益生菌，尤其是在糖尿病、肥胖、代谢紊乱等相关疾病的预防和治疗方面具有极大的潜力，对未来研究和开发具有重要意义。

3 AKK 的生物学特性及其在宿主中的代谢

AKK 最初由Derrien 等描述[13]，是一种椭圆形、非运动型、不产芽孢的厌氧革兰阴性细菌，可单独或成对生长，在含有黏蛋白的培养基中还可抱团生长。该细菌在黏蛋白培养基上生长时，在透射电镜下可见存在由荚膜聚合物构成的丝状结构。AKK 基因组中存在许多编码黏蛋白降解酶的基因，共78 个基因（占总基因的14%）被注释为可参与黏液降解，编码糖苷酶、唾液酸苷酶、蛋白酶和硫酸酯酶等[14,49-50]。而AKK 降解黏蛋白这一特性恰恰决定了它定植于黏蛋白丰富的肠道黏液层中的偏好。

肠黏液是由杯状细胞合成并分泌的，覆盖肠细胞，形成松散而坚固的黏液层，分为2 层：一层是没有细菌的内黏液层，一层是较厚的含有共生细菌的多层外黏液层[51-52]。黏液的主要成分为黏蛋白，黏蛋白是AKK 的营养源，它由大量O-连接聚糖修饰的肽骨架组成，肽骨架富含苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和脯氨酸，聚糖由多糖或糖基团，含有甘露糖、半乳糖、岩藻糖和N-乙酰基己糖胺，如N-乙酰-葡萄糖胺（Glc-NAc）或N-乙酰-半乳糖胺（Gal-NAc）[53]。AKK 存在于该黏液层中并代谢黏液，同时产生乙酸盐和丙酸盐，由黏蛋白酶释放的糖也促进其他细菌产生丁酸盐[54]。

像许多厌氧菌一样，AKK 被描述为产生短链脂肪酸（SCFAs）的发酵细菌。AKK 能够发酵的糖类包括半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、Glc-NAc 和Gal-NAc，但这些糖仅在黏蛋白或大量胰蛋白酶消化物或酪蛋白存在下才有可能降解[55]。由于黏液降解，AKK 产生寡糖和SCFAs，这些产物可以刺激微生物群的相互作用和宿主反应。寡糖和乙酸盐可以刺激靠近黏液层定植细菌的生长和代谢活动，同时抵抗那些必须穿过黏液层才能到达肠细胞的致病菌。由AKK 产生的丙酸盐可以通过短链脂肪酸受体43（Gpr43）作用于肠道组织，而其他SCFAs 也可以通过Gpr41 向宿主发出信号[56-57]，从而触发宿主表达机制的级联反应，并与其他信号通路一起，在仅有AKK 定植的无菌小鼠中产生免疫刺激和代谢信号达到免疫调节作用[58]。

最近的研究表明，尽管AKK 用黏蛋白作为营养源，但其与人类和动物的黏液厚度和肠屏障完整性呈正相关[26,40,59-60]，例如，AKK 的补充增加了小鼠产生黏液杯状细胞的数量[61]。AKK 促进黏液厚度的机制尚未完全清楚，很可能是一方面降解黏液蛋白生成许多短链脂肪酸，而短链脂肪酸是宿主上皮细胞合成和分泌黏液蛋白较好的能量来源；另一方面，黏液蛋白的降解可刺激杯状细胞产生更多新的黏蛋白，以降低宿主蛋白的沉积，而新生黏蛋白又刺激AKK 的生长，二者形成正反馈回路，这种良性循环使肠道黏液层不断更新，对肠上皮细胞也可起到良好的保护作用。

4 AKK 的分离培养

4.1 AKK 分离的概况

最近，研究人员从网状蟒蛇粪便中分离出与AKK 基因序列有95%相似度的细菌，命名为嗜多糖阿克曼菌[13,15]。2016 年，我国学者从172 份中国南方成人粪便样本中分离得到22 株AKK，并将它们分为12 个基因型，不同受试者体内的基因型别不同，其中3 个受试者中呈现多种基因型[31]。随后，该团队测序分析了来自人和小鼠粪便的39 株AKK，共鉴定出5644 个独特蛋白，遗传发育分析可将它们分为3 个谱系类群，分别表现出不同的代谢及功能特征[62]。

从人粪便中首次分离AKK 已有10 余年，在最初的5 年里，每年仅有1 篇关于AKK 的报道。自2010 年后AKK 逐渐受到关注，关于它与人体健康和疾病间关系的研究开始明显增多，但其分离培养方法的优化还处于停滞状态，如何快速分离和分型一直是研究瓶颈。现阶段的研究重点应关注从更多不同宿主体内分离大量AKK 菌株，并分析其基因和生理功能差异，寻找其中的特异菌株，为后续探索其与人体健康关系的研究提供新的支撑。因此，需要加大AKK 分离培养规模，并应着眼于AKK 培养条件的优化，为建立快速、准确的分离、纯化和鉴定技术奠定基础。

4.2 分离AKK 的样本选择

如何顺利准确地从人体中分离出AKK，样本的选择尤其重要，需要先确保所选对象中含有丰富的AKK，才能为后续分离培养实验的开展提供保障。在小鼠模型中，Derrien 等将AKK 定植于无菌小鼠体内，由于大部分的黏蛋白都在盲肠中产生[58]，因此该菌在盲肠中的定植数量最高。在仓鼠禁食实验中，发现禁食后的仓鼠体内AKK 丰度显著升高[63]。还有使用万古霉素处理糖尿病小鼠模型，发现该抗生素的处理可使小鼠体内疣微菌门的相对丰度由10%左右升高至87%[64]。用二甲双胍（常用的治疗Ⅱ型糖尿病药物）处理小鼠后，其体内的AKK 丰度也显著升高[61]。此外，增加AKK 丰度的方法还包括摄入双歧杆菌、低聚果糖、短链碳水化合物（FODMAP）、大黄提取物或特定抗生素等[65]。因此，欲从不同物种体内分离出AKK，可考虑使用上述刺激条件以提高动物体内AKK 丰度，利于顺利分离得到该细菌。

上述所提到的提高体内AKK 丰度的方式皆基于动物模型，为分离该菌对人群实施干预是不可行的。但AKK 在人体的定植状态较为稳定，在健康人群肠道中其丰度通常占1%～3%，而在肠炎病患者、超重肥胖人群及Ⅱ型糖尿病患者体内AKK 的数量和丰度均较正常人低[39]。但通过膳食控制或服用益生元，可改善健康状况使得AKK 丰度得到恢复甚至升高，同时避免高脂饮食和大量饮酒导致的肠道内AKK 丰度的降低[40,66-67]。合理饮食、健康作息、适当运动对维持人肠道内较高AKK 丰度是有帮助的。故在选择研究对象时要综合考虑上述因素，选择合适人群收集粪便作为样本，更有利于实验的顺利开展。

4.3 AKK 培养条件的选择及改进

AKK 在20～40℃和pH5.5～8.0 时都能够生长，最佳温度为37℃，最佳pH 值为6.5，孵育时间为3～7 d[13]。AKK 在最初的文献报道中被描述为严格厌氧生长，所需生长条件为：182 kPa、80%N2、20% CO2[13]；或90% N2、10% CO2[68]；或85% N2、10% CO2、5% H2[69]；或100% N（2ATCC 推荐）。在这些条件下均能顺利培养出AKK，并达到实验所需的菌浓度。但近期研究发现，与人类肠道微生物群的许多其他成员相比，AKK 是一种耐氧厌氧菌而不是严格的厌氧菌。实验数据表明[70]，AKK在厌氧和有氧环境下的生长无差别，将其放置在大气常氧水平条件下1 h，80%的AKK 仍保持细胞活性，表明该细菌能够在环境空气中存活，也说明该细菌不是对氧高度敏感的严格厌氧菌，而是具备一定的耐氧能力。

自首次成功分离AKK 后，用于其分离的培养基——黏蛋白基础培养基一直沿用至今。AKK可利用胃肠道黏蛋白作为惟一的碳源和氮源进行生长，黏蛋白培养基也是目前惟一的选择性培养基。2016 年，我国研究者用该黏蛋白基础培养基进行选择增菌，并在筛选过程中进行改进，挑取在平板上生长的单克隆接种至添加了万古霉素的还原性巧克力培养基中进行纯化，最终顺利分离得到AKK。在培养基中添加适量的万古霉素（5 μg/mL），可在抑制革兰阳性菌生长的同时刺激AKK 生长，更利于该细菌的分离筛选。但黏蛋白基础培养基的配制过程十分复杂，须添加多种微量元素，在日常实验工作中培养基的配制极其耗时。之后的许多研究中，发现在脑心浸液肉汤（BHI）或哥伦比亚肉汤（CBA）培养基中添加一定的黏蛋白来培养AKK，均能满足其生长的营养要求[15,59,61,71-73]。

目前，已知的适合培养AKK 的培养基均含有动物成分，而来源于动物的营养成分可能含有病毒、朊病毒、过敏原或细菌污染物，今后若将AKK的培养物用于人类食品或药品会受到质疑。2016 年，Belzer 等对培养AKK 的培养基进行了改造，并申请了专利[74]。他们用16 g/L 大豆蛋白胨加上25 mmol/L 混合糖（葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺）代替动物源的黏蛋白，观察到AKK 生长良好。此外，还发现通过添加一定量的苏氨酸或酵母提取物等也可刺激其生长。在该化学限定培养基上可获得高产量，有利于AKK 的大规模生产，满足了在食品、饲料或药物等方面的应用。同年，Plovier 等[75]在实验中重复了该培养基的使用方案，结果发现能够达到与传统黏蛋白基础培养基相近的培养效果。2017 年，我国学者改良了黏蛋白基础培养基的营养条件[76]，通过添加筛选到的生长刺激因子来提高AKK 的生长速度和菌液浓度。研究发现，AKK 在添加了低聚木糖、低聚半乳糖、环糊精和索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清这4 种生长刺激因子的培养基中生长速度快。其中10 g/L 索莱宝蛋白酶酶解鸡蛋清、5 g/L 环糊精、5 g/L 低聚半乳糖的组合物对细菌的生长促进效果最好，可使AKK 的生长时间由原来的5～6 d 缩短为24～36 h，且菌液D600nm值也由0.0697 升至0.7197，极大地促进了AKK 的生长。

5 结语

下一代益生菌产品包括拟杆菌属、梭菌属、阿克曼菌、粪杆菌属等[77]，其中AKK 作为一种潜在的肠道益生菌已成为研究热点。AKK 可以降低肥胖、糖尿病患者的炎症反应，改善肠道的屏障功能，还可以调节机体的免疫应答，维持体内代谢平衡，在癌症免疫治疗中也发挥着显著增效作用。这些都表明AKK 在肠道中的定植状态与宿主的健康息息相关。基于AKK 如此强大的益生作用，需要对其深入研究，为后续益生菌微生态制剂的研发提供科学依据。而这些研究与开发，都离不开AKK 菌株的培养与筛选。

作为肠道潜在的益生菌，AKK 也可能具有潜在致病性，其安全性有待研究。下一代益生菌产品是“双刃剑”，所以对菌株的安全性评价是首要问题，与传统益生菌产品（乳酸菌、双歧杆菌）相比，下一代益生菌产品在使用上须严格限定适用人群，实现精准施用。同时，还应重视下一代益生菌菌株抗生素耐药性基因在食物链中播散的评估，保证菌株对抗生素的药物敏感性。而针对AKK，目前研究者还聚焦在早期的安全性研究和菌株适宜性研究[78]。虽然阿克曼属是宿主肠道中广泛定植菌属，目前还没有表现出任何致病性[79]，但AKK 在不同物种体内定植表达和功能调控具有一定的差异，发挥的作用也不尽相同。同一种益生菌的不同菌株之间对宿主健康的影响也是存在差异的[80]，因此，为研究菌株和疾病间的因果关系，研究者不能只把培养目标定在种水平上，而应尽可能地建立菌株水平的菌种库以供筛选和鉴定，同时研究其分子作用机制，为人类健康助力。