王淑云

（河南科技学院新科学院，河南新乡 453000）

去甲雄三烯醇酮（17β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one）的商品名称是A-群勃龙（Trenbolone，TRE），是一种人工合成的甾类雄性激素。TRE作为生长促进剂，能够提高瘦肉产出率和饲料转化率，在动物饲养中被大量使用。运动员服用TRE可提高体内雄性激素的含量，进而提高运动成绩。为避免人类因长期摄入激素残留物或其代谢物而引起发育、神经、遗传毒性和癌症问题[1]，我国农业部第235号文件中规定TRE在动物性食品中不得检出[2]。

本文就TRE及其同类蛋白同化激素的检测技术进行阐述，为TRE检测试纸条和蛋白质芯片等最新技术的探索提供参考。

1 理化分析方法

TRE样品具有基质复杂、效应明显、干扰物较多、浓度水平低等特点，为了准确定性且精确定量其残留量，检测方法必须灵敏、准确、特异性强。目前TRE样品的理化检测检测方法主要包括:高效液相色谱法（HPLC）、薄层层析法（TLC）、气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）和液相色谱-质谱法（LC-MS）等。

1.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法具有分离效能高、灵敏度高、应用范围广、分析速度快等特点，适合高温不稳定、沸点高的大分子物质的分析检测，其缺点是检测中用到的一些有机试剂对人体有害。19世纪80年代，HPLC开始应用于蛋白同化激素的分析检测。2008年汤艳荣[3]等介绍了另一种用于激素和抗生素检测的新方法“超高效液相色谱法”。与传统高效液相色谱法相比，超高效液相色谱法在速度、灵敏度及分离度方面分别是高效液相色谱法的9倍、3倍及1.7倍，但易出现假阳性结果或产生交叉反应。

1.2 薄层层析法

薄层层析法是一种快速且微量的层析检测方法，具有高分辨能力、分析速度快、技术简单、操作容易、结果直观、不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。这种方法可用于复杂物的分离、提纯以及含量测定，适用于残留物的检测。1989年VanLook[4]用薄层层析法检测牛体内包含TRE等30多种激素，检测限达到1～10μg/kg。

1.3 气相色谱法

气相色谱是20世纪50年代出现的一项分离、分析技术，具有样品用量小、检测速度快、灵敏度高等优点，在医药卫生、食品安全、竞技场兴奋剂的检测等方面都有广泛的应用。1965年，Beckett第一次用GC检测到运动员滥用药物；1972年，Donike[5]用气相层析仪检测鸦片和兴奋剂类等蛋白同化激素；1991年Bagnati[6]用气相色谱法检测TRE等蛋白同化激素，其检测限达到0.02～0.06μg/kg，回收率为35%～87%。

1.4 气相色谱-质谱法

气相色谱-质谱法是20世纪50年代开发的一种结合气相色谱和质谱特性的分析检测方法。该方法具有定性准确、灵敏度高等特点，主要用于鉴别挥发性和热稳定性强的物质，是目前检测蛋白同化激素残留的最常见方法。GC-MS最早用于检测蛋白同化激素是在1983年委内瑞拉举办的泛美运动会上。1988年，Shih Hsu[9]用GC-MS检测牛组织中的TRE，在牛肉和牛内脏中的检出限为0.5μg/kg。2007年，韩丽[8]用GC-MS法检测TRE在动物组织中的残留，定量限达1.0 μg/kg。

1.5 液相色谱-质谱法

液相色谱-质谱法可以有效分离和检测那些不易挥发、易分解的复杂化合物，并且不需要像GC-MS进行衍生化。Hong[9]在2009年采用LC-MS检测牛肝脏中TRE残留，其平均回收率是62%～69%，检测限是1μg/kg 。吕惠卿等用LC-MS测定牛奶中TRE残留，其检测限为0.3 μg/L，添加回收率为59.2%～90.7%。LC-MS与GC-MS比较，有效提高了检测限，是复杂化合物检测分析的有效手段。

色谱/质谱分析法是检测TRE残留的主要方法，但检测前样品的处理比较复杂，需要在专业实验室由专业工作人员操作，且仪器价格昂贵，检测所需时间较长，平均需要2 d以上，不能满足养殖户自检和现场检测的需求。

2 免疫学检测方法

免疫分析方法（Immunnoanalysis，IA）是以抗原抗体的特异性、敏感性、可逆性反应为基本原理，以不同的抗原抗体反应载体为技术建立起来的分析方法。其优点是试样体积小、灵敏度高、特异性强、检测速度快、操作简单且价格低廉，可以实现现场检测和大批量检测[10]。免疫学检测方法包括酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、放射性免疫分析法（radioactive immunoassay，RIA）、胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatography assay，CGICA）和化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）等方法。

2.1 酶联免疫检测

ELISA是一种固相吸附免疫测定技术，其原理是将已知的抗原（或抗体）包被到固相载体表面，保留包被物、酶标记物免疫活性，利用抗原抗体的特异性反应使酶与待检物结合，然后根据酶与底物的催化显色程度，进行定性定量测定。

2004年，Fitzpatrick J[11]等采用基于TRE多克隆抗体的ELISA法对牛胆汁中TRE的残留进行检测，检测限为3 ng/mL；2010年周成林[12]等研究了TRE的化学修饰及其免疫原性的构建，并用ELISA检测得到TRE特异性抗体，其效价为l∶3.2×105。ELISA免疫学检测方法研究进展很快，尤其是使用了标记的抗原和抗体的分析技术，在特异性和敏感性方面都要远远优于经典的分析技术，这使得ELISA检测法在生物医学领域的应用范围日益扩大。

2.2 放射性免疫分析法

放射性免疫分析法于1960年创立，是以放射性核素为标记物的一种免疫分析法，其基本原理是标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争结合反应，最早被用于测定糖尿病人血浆中胰岛素的含量。放射性免疫分析法特异性强、灵敏度高、样品用量少、操作简单、精密度高，且大小分子量的物质都可以测定，在医学上的应用十分广泛，也常常被用来检测蛋白同化激素的残留量。例如，1976年加拿大奥运会上采用RIA来检测蛋白同化激素（包含TRE）的残留[13]。但是，RIA的缺点是使用了放射性的核素，有损工作人员的健康，且需要专业操作人员在专业实验室进行。此外，核素还有半衰期，造成试剂盒有效期较短，有时还会出现假阳性反应和交叉反应，因此大大限制了RIA的使用性。从科技发展前景来看，放射性免疫分析技术将逐步被其他标记免疫分析技术取代。

2.3 化学发光免疫检测

化学发光免疫分析是将具有高特异性的免疫反应与高灵敏度的化学发光系统相结合，用于抗原、半抗原、抗体、激素、维生素等定性或定量的分析检测。2003年，Roda[14]报道了一种灵敏、快速、简单的化学发光免疫检测方法，该方法可以在几分钟内完成检测，不仅试剂用量只有96孔酶标板的1/5，且检测费用较低，非常适合大批量检测。2015年，沈克强[15]用CLIA检测TRE，TRE多克隆抗体对TRE的50%抑制浓度（IC50）和15%抑制浓度（IC15）分别为0.094 μg/L和0.00330μg/L，与传统的酶联免疫吸附分析方法相比,灵敏度提高了5-8倍。近年来，CLIA由于其适用面广、特异性强、灵敏度高、所需设备简单等优点，在实际中应用已经越来越广泛。

2.4 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术就是以胶体金为显色媒介，利用免疫学原理，在层析过程中完成抗原抗体的特异性结合，从而达到检测目的的一种方法。1971年，Faulk[16]把胶体金颗粒与兔抗沙门氏菌抗血清结合形成金标抗体，用于检测抗原在细菌表面的分布，这标志着免疫学研究领域又增加了一种新型的有色标记物——胶体金。2007年，Liu[17]研制出一种免疫层析试纸条，这种试纸条不仅能够快速定性，在10min内得到检测结果；且无需设备、灵敏度高，可以用肉眼直观判定阴性/阳性结果，非常适用于现场的快速检测。随着免疫层析技术的快速发展，其在疾病诊断、食品安全、药物检测等领域将得到更加广泛的应用。

2.5 蛋白芯片技术

蛋白芯片技术是一种微型、灵敏度高、特异性强的新兴技术。原理是把已知蛋白固定在玻璃等载体上，形成高浓度的分子排列，当芯片上的探针分子与标记物的靶分子结合后，通过激光共聚焦扫描或光耦合元件（CCD）对标记信号的强度进行检测。2009年，Kloth[18]把蛋白芯片技术应用到食品中药物污染的检测中。

3 展望

目前在TRE的检测方法中，气相色谱法、液相色谱法等理化检测方法是定量法，酶联免疫吸附测定等免疫学检测方法是筛选法。但随着TRE高灵敏度、高亲和力的单克隆抗体的获得，免疫学检测结果与理化检测方法的相关度越来越高。免疫学检测方法与理化检测方法相比具有操作便捷、节约时间、费用低廉、携带方便等优点，在TRE残留的检测中拥有更广阔的发展空间，特别是胶体金免疫层析技术和蛋白芯片技术已经成为TRE残留检测技术的发展方向和研究热点。