陈文凤，郭雅玲

（福建农林大学 园艺学院，福建 福州 350002）

乌龙茶是六大茶类之一，以其天然浓郁的花果香型和醇厚回甘的品种韵味有别于其他茶类，兼具绿茶的清爽高香和红茶的鲜浓醇厚，素以滋味醇厚、花香浓郁、品种繁多而闻名天下，有着“茶中香槟”的美誉。其制作工序为：摊青、做青、杀青、揉捻、包揉、干燥。做青是形成乌龙茶独特品质的关键工序，也是奠定乌龙茶独特香气和滋味的基础。

做青是摇青和静置交替进行的过程，做青过程相当于机械伴随水分胁迫的逆境条件，植物在逆境条件下体内发生一系列的生理生化变化[1]。做青引起的机械损伤以及水分的适度散失，一方面刺激了细胞内各种内含物的转化，另一方面也为离体叶片营造了一个逆境环境，促使细胞内发生微妙的变化，如细胞膜透性改变、多酚类物质氧化、物质水解、脂质降解、叶绿素破坏等，这些变化为乌龙茶独特品质的形成奠定基础[2]。

做青叶细胞内部的研究主要集中在做青过程中细胞结构变化、酶活性变化、脂质过氧化等[3-4]；近几年，随着茶树分子生物学的快速发展，也展开了对乌龙茶做青叶片内部的分子机制的初步研究[5]。

1 乌龙茶叶片结构的独特性

制作茶叶，必须要讲究茶鲜叶的适制性，制作乌龙茶的鲜叶要求表面角质层和蜡质层要厚，防止摇青后出现死青。严学成[6]对乌龙茶不同叶位的叶片进行超微结构观察，发现适制乌龙茶的茶树品种鲜叶特征为：从芽下第一叶到第四叶，叶片内的叶绿体结构逐渐发生分化、叶绿体片层增多，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量呈递增趋势，第三叶的叶绿体出芽产生原生质体，并指出适制乌龙茶各品种的成熟叶普遍存在叶绿体出芽产生原生质体的现象，这是适制乌龙茶鲜叶有别于适制其他茶类鲜叶的特性。

2 做青叶细胞内部结构变化

做青期间叶片发生碰撞，使叶片细胞组织损伤与器官发生变化。黄晓敏[7]对乌龙茶鲜叶与做青叶叶片显微结构进行比较研究，发现与鲜叶相比，做青叶片有水纹状皱缩，叶脉下陷，叶表面粗糙，上表皮角质层不清晰，下表皮细胞不完整，海绵组织更加疏松，表明做青使鲜叶内部结构发生变化。

3 做青叶细胞酶的变化

做青的目的是让叶片内发生适度的酶促氧化，促进做青叶内部物质转化与积累，逐步形成花香馥郁、滋味醇厚的内质和绿叶红边的叶底。做青叶内的酶活性与做青程度密切相关，做青过程中的内源酶活性直接影响成品茶品质特征[8-9]。

3.1 氧化还原酶类

多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）是乌龙茶加工过程中重要的氧化还原酶类。

禹利君等[10]初步探明了乌龙茶做青叶片内POD 和PPO 的变化规律，整叶中的PPO 活性在做青过程中呈现先上升后下降的趋势，而POD活性则呈现先下降后上升的趋势；整叶、叶缘、叶芯这三者的PPO 和POD 活性变化规律不同，且PPO 与POD 的变化规律是相反的。黄福平等[11]进一步推测了做青前期PPO 活性的增加并未明显导致多酚类物质下降的原因是做青前期细胞破损率和膜透性都很低，而在做青后期细胞质膜通透性增加，使细胞内的酶与底物充分接触，促进多酚类物质氧化；并发现细胞质膜透性过度加大会造成多酚类物质与蛋白质聚合沉积，不利于乌龙茶良好品质的形成，指出以不导致做青叶细胞质膜通透性急剧增大，引起多酚类物质显著下降为乌龙茶做青适度的生化指标之一。

王尔茂等[12]进行了不同做青方式对内源酶的影响研究，发现POD、PPO 和SOD 活性变化趋势较一致，总体呈现先上升后下降的趋势，做青结束时POD 和PPO 的活性均高于做青前的活性，且手工摇青叶的酶活性显著低于机械摇青叶的酶活性；SOD 的活性的变化虽然也是先上升后下降的趋势，但是做青结束后的酶活性要低于做青前时的活性，这是因为做青叶细胞受到外力的胁迫使SOD 活性上升以清除自由基，但随着摇青次数的增加，自由基大量上升，导致SOD 活性下降。他指出做青使细胞膜结构遭到破坏，酶与底物的接触程度影响着茶多酚氧化和其他生化反应的程度，表明做青应讲究做青适度，过度做青不利于良好品质的形成。

陈敏星[13]也研究了做青过程中做青叶片的PPO、POD 的活性变化，发现做青叶POD 活性在四摇前一直上升并达到最大，但到做青结束时活性降低，猜测可能是由于做青叶的含水率较低导致的；PPO 活性呈下降上升下降上升的“W”型变化；做青后PPO 和POD 的活性均高于做青前，这与前人研究结果一致。

3.2 水解酶类

3.2.1 蛋白酶

蛋白酶是一种内源水解酶，可将茶叶中的蛋白质水解成各种氨基酸[14]。王若仲等[15]研究发现做青可增加叶片内蛋白酶的活性，使叶片内的可溶性蛋白和氨基酸含量增加。做青前中期，蛋白酶活性叶缘＞整叶＞叶芯；做青结束时，蛋白酶活性叶缘＞叶芯＞整叶。通过做青工艺，适当的调控蛋白酶活性，将有利于可溶性蛋白和游离氨基酸的适度积累，促进乌龙茶优良品质的形成。

3.2.2 果胶酶

果胶酶的主要作用是分解植物组织细胞壁和细胞间的果胶物质，进而使细胞壁解体并增加细胞间的通透性，促进植物组织呼吸作用和物质代谢[16]。唐颢[17]对金萱和白叶单枞做青过程中内源果胶酶活性的动态变化进行研究，结果表明：摇青处理酶活性显著高于不摇青处理，摇青前期酶活性逐渐增强，在第三次摇青结束时达到峰值，且可溶性糖的含量在此期间积累，使得叶质变软，降低了做青叶之间的摩擦强度，保证做青叶能够顺利“走水”，为后续的可溶性糖的转化保留以及其他品质生化成分的保留奠定物质基础。此后的第四、五次摇青酶活性迅速下降，可能与在制品内含物转化和呼吸代谢有关。

3.2.3 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶是乌龙茶香气前体物质释放过程中的一种重要水解酶，其活性的变化直接影响着制茶品质尤其是香气品质的形成[18-21]。张秀云[22]等研究了萎凋做青过程中β-葡萄糖苷酶活性的变化，结果表明，萎凋做青期间β 葡萄糖苷酶活性呈盘峰变化趋势，做青结束前约2 h达到整个做青过程的巅峰值；做青后期，β-葡萄糖苷酶活性下降，推测可能是因为在临近做青结束时，茶鲜叶失水较多、细胞膜透性增大、多酚类物质的酶促氧化作用增强，氧化还原酶的强活性抑制了水解酶的活性，导致β-葡萄糖苷酶活性降低。陈艺元[23]也对摇青工艺中的酶活性进行了研究，发现摇青可以提高酶的活性，机械力使细胞内的液泡损伤，促进液泡中的糖苷类前体与β-葡萄糖苷酶接触，酶活性的峰值出现在第一次和第二次摇青完成时，随后晾青过程中活性下降，此研究结果与张秀云的研究结果基本一致。吴乔[24]等的研究结果表明，β-葡萄糖苷酶的活性在低温（17℃）条件下被抑制；高温（27℃）虽然能促进β-葡萄糖苷酶活性的增加，但叶片内呼吸作用的增强会增加内含物质的消耗，不利于乌龙茶良好品质的形成；室温22℃不仅能增加酶活性，而且也能保证做青的品质。做青引起的机械损伤以及水分的适度散失，一方面刺激了细胞内各种内含物质的转化，提高了β-葡萄糖苷酶的活性；另一方面，这种损伤不至于造成细胞死亡，反而通过摇青的“走水还阳”作用维持了细胞的活力，使细胞内的物质转化和呼吸作用得到合理控制。

3.2.4 纤维素酶

纤维素酶可使细胞壁降解，从而促进细胞间的物质、水分转运和酶促反应进行。唐颢等[25]对做青期间纤维素酶活性进行研究，发现做青叶纤维素酶活性高于不做青叶纤维素酶活性，做青叶在二摇前，纤维素酶活性上升快，且可溶性糖含量增加，但随着摇青次数的增加，纤维素酶活性减弱，这可能是由于细胞受损增加，多酚类物质增多，产生的蛋白质沉淀增加，导致酶活性下降。可以推断做青前期，纤维素酶活性的增加为可溶性糖的积累提供物质基础，参与乌龙茶滋味品质的形成。

4 做青过程中脂质过氧化

植物在正常生长条件下，体内活性氧的产生和清除处于动态平衡，当处于各种逆境胁迫时这种平衡被破坏，引发脂质过氧化，导致细胞流动性和通透性发生改变。

黄福平等[26]等研究结果表明，摇青和自然萎凋均能促进膜脂过氧化产物（丙二醛MDA）积累。陈敏星[13]研究结果表明梅占做青叶在三摇前MDA 含量一直下降，三摇后直到做青结束，MDA 含量持续上升。温立香[27]等研究发现，水分与脂质过氧化极显著正相关，做青叶片随着做青进程的增加，其细胞内部的MDA 含量和自由基H2O2含量持续上升。

5 线粒体的变化

线粒体是细胞中产生活性氧的一个重要部位，是细胞凋亡的调控中心，在细胞凋亡中起关键作用[28-30]。植物细胞凋亡主要包括植物自身发育过程中的细胞凋亡和环境作用影响的细胞凋亡[31]。逆境条件下，当线粒体膜受到损伤时，膜电位就会降低，线粒体膜上的通透性转化（MPT）现象是线粒体结构功能发生改变的重要分子机制[32-33]。

温立香[27]研究了乌龙茶做青过程中线粒体的理化变化，发现叶片线粒体膜吸光度从鲜叶至做青结束逐渐下降，说明摇青刺激细胞内线粒体膜通透性转化（MPT）的发生；乌龙茶做青过程中叶片线粒体中的MDA 和H2O2含量都逐渐增加，说明了做青导致叶片线粒体被活性氧毒害。

目前对于乌龙茶做青过程中细胞内是否会发生凋亡现象及与凋亡密切相关的线粒体的变化方面研究鲜少，但在其他植物上的研究已有报道[34-35]，做青相当于一个逆境胁迫的过程，可参考已有逆境对细胞变化影响的研究，将其运用在做青叶内部微观的细胞学研究上，从而揭示乌龙茶做青的内在机理。

6 乌龙茶做青过程基因表达

6.1 GGDPS 基因

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（Geranyl geranyl diphosphate synthase，GGDPS），是植物萜类物质合成途径中的关键酶之一。姚雪倩等[36]等克隆出铁观音CsGGDPS 基因并利用实时荧光定量技术检测该基因在做青过程中的表达模式。结果表明，从鲜叶到晒青叶，该基因表达量较低且增长较慢，但随着摇青的进程表达量显著增加，且在杀青前表达量达到最高，约为鲜叶的20倍，推测该基因参与乌龙茶萜烯类香气品质形成。

6.2 CsID 基因

陈丹[37]等克隆与萜类化合物形成相关的异戊烯基焦磷酸异构酶（CsIDI1 和CsIDI2）并利用实时荧光定量PCR 技术检测此基因在做青过程中的表达变化，发现做青过程中，CsIDI1 和CsIDI2 基因表达量上升，这与前人的研究结果一致，表明CsIDI1 和CsIDI2 基因在乌龙茶做青过程中受到胁迫促进萜类香气物质的形成。

6.3 CsMVK 基因

王鹏杰[38]等克隆出与萜类化合物形成相关的酶基因（CsMVK 基因）并实时荧光定量 PCR检测此基因在做青过程中的表达特性，发现乌龙茶在做青过程中，CsMVK 基因在晒青到一摇过程表达量下降，但经过3 次摇青，表达量在杀青前达到最大值，推测 CsMVK 基因在做青过程中受到机械力的损伤使其表达增加，参与茶叶萜类香气物质的形成，这也与前人研究的做青期间可促进香精油的积累相符[39-40]。

6.4 CsTPS 基因

单萜合成酶（monoterpene synthases, mono,TPs）是植物单萜化合物合成途径的限速酶。王鹏杰[41]等克隆了CsTPS 基因并利用实时荧光定量PCR 技术研究该基因在乌龙茶做青过程中的表达模式，结果表明，该基因从鲜叶到晒青阶段表达量显著增加，晒青叶的表达量是鲜叶的3倍，一摇二摇后表达量下降，三摇和杀青前期表达量显著上升，且杀青前期表达量是鲜叶的3.8倍，推断该基因参与乌龙茶香气品质的形成。

6.5 CsNCED 基因

做青过程相当于茶树叶片处于逆境胁迫的过程，脱落酸在植物逆境胁迫响应中发挥着重要作用。9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶NCED是植物ABA 生成的关键酶，王赞[42]等克隆出与调控ABA 含量密切相关的铁观音CsNCED2基因，并实时荧光定量PCR 检测此基因在乌龙茶做青过程中的表达模式，发现从鲜叶到晒青结束，CsNCED2 表达量显著增加并达到第一个峰值，之后的摇青其表达量下降，到杀青前，CsNCED2 表达量显著上升，达到最高。说明做青过程此基因表达量显著增加，激发了以ABA含量为基础的气孔开闭和胁迫氧化应激反应。Cho 等研究发现NCED 在做青过程中表达存在显著差异[43]。

7 展望

目前对乌龙茶做青过程中叶片的研究主要集中在叶片的生化成分、叶片内的酶、香气、脂质过氧化等的研究上，但对于做青过程中与品质形成相关的分子研究尚处于初始阶段。近几年，随着分子生物学技术的快速发展，对于乌龙茶品质形成的分子机制研究需要深入到细胞或亚细胞水平上，更精确地去探明乌龙茶品质形成的内部调控机制[44-45]。随着科学技术手段的提升与发展，乌龙茶做青将从宏观的工艺研究转向微观的细胞学研究，深入探究乌龙茶做青与品质关系的内在机理，为乌龙茶做青的技术经验提供理论支持，也为乌龙茶工艺优化、品质提高和高效生产奠定理论基础[46]。