黄学锋，李燕

(温州医科大学附属第一医院生殖医学中心，温州 325000)

常规体外受精(IVF)的受精率通常在70%～85%，有5%～15%的周期出现完全受精失败(total fertilization failure，TFF)。其主要原因是精子缺乏正常受精能力，但采用卵胞浆内单精子注射(ICSI)通常可获得受精。虽然ICSI已可以获得与IVF相似的正常受精率，但ICSI后也会发生TFF(ICSI-TTF)。ICSI-TFF是指所有成熟卵子行ICSI后未能形成雄性和雌性原核，其文献报道的发生率为1%～4%[1]。本文就ICSI-TTF的发生机制、原因以及临床处理策略综述如下。

一、ICSI后卵子受精失败的机制

1.受精机制：哺乳动物卵子受精过程包含精子获能、透明带结合、精子卵子膜融合和卵子激活等一系列生理过程，最终导致卵子减数分裂恢复和原核产生。在ICSI时，卵子激活是受精的必要过程。目前认为，精子进入卵子后释放精子特异性卵子激活因子(sperm-borne oocyte activation factor，SOAF)是卵子激活的主要机制。SOAF可引起膜电位改变，引起钙离子释放和震荡，从而导致减数分裂恢复和原核产生[2]。

2.ICSI后卵子受精失败的机制：ICSI后卵子受精失败的原因可能是精子未注入卵子，但主要原因是卵子激活失败。Flaherty等[3]对1 005个ICSI未受精卵进行Hoechst 33342核染色，通过分析精子头核的形态、位置以及原核和极体数目，发现只有18%的卵子形成原核显示已被激活，82%的卵子无雌性原核形成表明未被被激活，其中，17%卵子未注入精子，83%的卵子显示精子虽然已注入到卵子但未见原核形成。

ICSI后卵子激活失败(oocyte activation failure，OAF)的原因可能是精子SOAF异常，也可能是卵子激活信号通路异常[2]。目前认为磷脂酶Cζ(phospholipases C zeta，PLCζ)是主要SOAF，是钙离子振荡诱导蛋白的最主要候选者[4]。Hachem等[5]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立PLCζ基因缺失小鼠模型，发现PLCζ缺失小鼠精子生成和精子质量参数正常，但是卵母细胞不能产生Ca2+振荡，表明PLCζ在触发Ca2+震荡过程中的重要作用。顶体后鞘WW-结构域结合蛋白(post-acrosomal WW-domain binding protein，WBP2NL/PAWP)也可能是钙离子振荡诱导蛋白之一，但尚存争议[6]。

在SOAF触发激活过程中，卵子需具备钙离子释放、震荡、减数分裂恢复和原核形成等过程的相关正常信号通路。PIP2、IP3R、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和Ca2+相关蛋白等物质参与这些信号通路[2]。这些物质及相关信号通路异常可能是OAF的卵源性因素[2]。

二、ICSI后完全受精失败的原因和分析

在ICSI临床中，不同精子和成熟卵子的质量可能不同，并不都具有正常激活机制。ICSI技术因素可导致精子未注入卵子和卵子激活失败。在出现完全受精失败时，需要分析其原因可能是随机的配子因素和操作技术因素，还是大部分甚至所有配子激活机制异常导致的OAF。

1.技术操作及随机因素：技术因素主要由于精子未注入卵子或注入精子未激活卵子，包括精子制动时膜损伤不充分、回吸卵胞浆不足、注射时没有很好地避开纺锤体位置，注射针质量等也有可能影响ICSI受精率。在人员培训严格和质控工作到位的生殖中心，可以较容易发现这一技术因素。

获卵数较少的周期发生ICSI-TTF在除外明显精子和卵子因素后，要考虑随机因素的可能。其理论概率可以通过实际ICSI受精率计算。以目前大部分胚胎实验室70%～85%的ICSI受精率计算，理论上1、2和3个成熟卵子不受精的随机概率约为15%～30%、2.25%～9%和0.3%～2.7%。这是大部分ICSI-TTF发生在获卵数少的周期的主要原因。分析我中心2014～2017年共5 926个ICSI周期数据，共150个周期出现TFF，发生率为2.52%，其中1、2、3和≥4个卵周期的TTF发生率分别是26.8%、11.9%、1.9%和0.32%，而<4个和≥4个卵周期发生TFF的占比分别是78.5%和21.5%。

2.精源性因素：在采用不活动精子、严重畸形精子、圆头精子和非梗阻性无精子症睾丸精子行ICSI时可出现不同程度的ICSI受精率低下和TTF，这些精子的SOAF候选蛋白PLCζ可出现表达和定位异常[7]。正常精液参数的精子也可出现SOAF异常，在原因不明ICSI-TTF中，精子PLCζ阳性精子比例、总量和分布与ICSI受精率显著相关，PLCζ的缺失、表达部位异常以及活性降低都可导致卵子激活失败，导致ICSI受精率低下甚至是TFF的发生[8-9]。也有发现精子PAWP的表达水平与ICSI受精率以及胚胎发育情况相关[10]。

3.卵源性因素：异常卵子形态增加了发生TTF的风险。有报道一例形态异常的卵子，采用自身精液、供精和卵母细胞辅助激活(assisted oocyte activation，AOA)均不能受精[11]。

目前研究未发现有明确临床意义的卵源性激活特异相关分子。精子释放 PLCζ进入卵母细胞质后，启动了激活连锁反应，包括PIP2、IP3R、PKC和Ca2+相关蛋白等众多物质参与这些不同信号通路[2]，这提示卵子因素激活失败可能存在复杂的分子和通路机制。有文献报道一例反复TFF，其配偶的人精子鼠卵激活实验(mouse oocyte activation test，MOAT)显示为正常，但卵子的30 000个基因mRNA芯片结果表明，控制细胞周期的基因表达谱发生异常[12]。

4.精源性和卵源性因素OAF的鉴别：在精子和卵子形态正常，而成熟卵子数较多(≥4～5)时，ICSI-TTF是由于技术和随机因素导致的可能性较小，需要考虑原因不明OAF。PLCζ的检测可能有助于鉴别精子因素，但尚不能用于临床常规检测。采用激活失败夫妇的精子和卵子与供卵和供精行交叉试验有助于鉴别精子或卵子因素受精失败。患者精子与捐赠的废弃不成熟卵子体外培养成熟卵子行ICSI，完全无受精，考虑精源性因素；受精率≥30%～50%，考虑卵源性因素；其他结果难以明确鉴别。也可采用患者卵子与供精ICSI试验以帮助鉴别。采用人卵子和精子交叉试验存在卵子来源、伦理以及体外成熟卵子本身可能存在激活异常等问题，而且当试验卵子数量较少时增加了试验的假阴性率，降低了试验的可靠性。

MOAT也被用于鉴别OAF的原因。通常采用B6D2F1杂交小鼠卵子与被测精子行ICSI。MOAT激活率与正常对照相比，无显著性差异为卵源性因素，MOAT 激活率低或无激活提示精源性因素[13]。MOAT需要设立阳性对照组、阴性对照和空白对照组，实验结果可靠需要三组的2-细胞率分别>90%、<10%和<10%。也有文献认为测试精子的MOAT 激活率≤20%，提示为精源性因素；MOAT 激活率在21%～84%之间，提示为精子或其他原因；MOAT 激活率≥85%，则提示为卵源性因素[14]。该方法的缺点是小鼠精子PLCζ作用不及人精子，可导致假阴性。

最近有报道采用小鼠卵钙分析(mouse oocyte Ca2+analysis)和人卵钙分析(human oocyte Ca2+analysis)作为鉴别精源性或卵源性因素OAF的方法[15]。

三、ICSI-TFF的临床处理

对严重精子和卵子形态异常及成熟卵子数较少的ICSI周期，ICSI治疗前要考虑其出现ICSI-TTF的风险。随机和技术因素的ICSI-TTF再发风险小。原因不明OAF导致的ICSI-TFF较难预测，而且可反复发生[16]，需鉴别精子或卵子因素。精卵交叉试验、MOAT和精子PLCζ的免疫荧光检测等有助于鉴别，可作为临床处理的主要依据。以下综述了ICSI-TTF的临床处理方法。

1.改善临床促排方案，增加卵子数目，改善卵子质量：卵母细胞核和细胞质的不成熟状态可能抑制卵子对精子PLCζ激活的反应[17]。在临床实践中应优化促排卵方法尽可能改善卵子质量，增加卵子数量。文献报道这可以改善成熟卵子少导致的ICSI-TFF的受精率，虽然移植周期的活产率可能仍然不高[18]。

2.改善精子质量，选择形态正常的活精子：严重精子异常导致的ICSI-TFF可在治疗前改善精子质量，ICSI时选择形态正常的活精子，但临床少有报道。可以借助精子尾部低渗膨胀试验(HOST)、Laman光谱显微镜等选择活精子，也可采用形态学选择性卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic morphologically selected sperm injection，IMSI)。

3.卵母细胞辅助激活(AOA)：AOA技术可以有效克服因OAF引起的TFF或受精率低下，并能获得正常发育的胚胎，是目前临床上针对反复ICSI-TFF的有效治疗。AOA还应用于圆头精子症[19]，也有应用于高ICSI-TFF风险的不活动精子和严重形态异常精子[20]。

AOA的基本原理是通过增加卵母细胞内Ca2+浓度，模拟自然受精时卵母细胞胞质内的生理变化。AOA的方法主要有3种：机械激活、电激活和化学激活。机械激活属于ICSI技术改良的一部分。行ICSI时，在注射针对侧区域多次抽吸以增加机械刺激，可提升TFF病人的受精率和临床妊娠率。Ebner等[21]对ICSI-TFF采用机械激活获得53.6%的受精率和33.3%的妊娠率。Tesarik等[22]也认为反复抽吸卵母细胞胞质可以增加溶液中Ca2+进入细胞内，同时破坏卵胞质中的内质网系统，从而增加内源Ca2+的释放，达到改善患者受精结局的目的。但应注意避免因反复抽吸胞浆而造成卵母细胞死亡。

电激活法则通过对卵母细胞施加直流电，引起卵母细胞膜蛋白的重排而形成膜孔道，细胞外的Ca2+可以通过孔道内流进入胞浆，从而诱发细胞内Ca2+浓度升高。Manipalviratn等[23]利用电激活技术，ICSI后胚胎形成率从16%提高到80%。但基于电激活操作的安全性和复杂性考虑，目前采用电激活进行AOA的临床报道较为少见。

化学激活法由于非侵入性和操作便利性在临床上应用最为广泛。目前有Ca2+载体、氯化锶(Strontium chloride，SrCl2)、无水乙醇和6-二甲基苯胺嘌呤(6-dimethylaminopurine，6-DMAP)、嘌呤霉素(puromycin)等化学激活剂。Ca2+载体、嘌呤霉素和6-DMAP能够增加膜穿透性，通过 Ca2+的跨膜转运触发Ca2+内流，迅速产生单个Ca2+峰，促进卵母细胞激活。氯化锶、无水乙醇可以将细胞内质网中的Ca2+释放到胞质内形成钙震荡[2，24-25]。其中A23187和离子霉素(ionomycin)是最常用的Ca2+载体激活剂。一项涵盖14项研究的Meta分析[26]显示，钙离子载体可以显著提高受精率、卵裂率、囊胚形成率、临床妊娠率以及活产率。A23187还具有改善胚胎发育潜能的作用，一项前瞻性多中心研究[27]显示，在具有胚胎发育阻滞、发育延迟或者之前囊胚形成率很低的患者中，应用A23187可以显著提高2-细胞卵裂率(98.5% vs.91.9%)、囊胚形成率(47.6% vs.5.5%)、种植率(44.4% vs.12.5%)、临床妊娠率(45.14% vs.12.8%)和活产率(45.14% vs.12.8%)。Nikiforaki等[28]在B6D2F1小鼠卵和人卵中比较了离子霉素和A23187的激活效率，结果显示离子霉素诱导的卵母细胞胞质内的Ca2+振幅更高、区域更广。在鼠卵中，离子霉素的激活效率显著超过A23187，而在人卵中，离子霉素的激活率也高于A23187，虽然差异无统计学意义。另一项RCT研究[29]表明，虽然SrCl2和A23187都能改善临床结局，但这两种激活剂对不同的病人作用不同。SrCl2的作用在低受精史的病人中优于A23187，但A23187在男性因素的病人中的作用优于SrCl2。因此，对不同ICSI-TFF选择不同的化学激活剂可能有助于治疗结局。

AOA技术可适用于精子和卵子因素ICSI-TFF，但应用于精子因素TFF的临床结果较好。最新的一项研究[30]对应用AOA技术的191周期分为精子因素组(MOAT激活率≤20%)、精子相关的卵激活能力下降组(MOAT激活率为21%～84%)和疑似卵子因素组(MOAT激活率≥85%)，三组的受精率分别为70.1%、63.0%和57.3%，其中精子因素组临床妊娠率(49.0% vs.29.4%)和活产率(41.2% vs.22.1%)均显著高于疑似卵子因素组。最近的一些研究随访了AOA出生子代。Miller等[31]比较了83例AOA出生的子代与595例ICSI子代，两组的子代出生缺陷率和缺陷类型、子代出生体重、孕周、胎儿性别均无显著差异。Deemeh等[32]比较了79名AOA出生子代和89名常规ICSI子代，显示两组的出生缺陷、子代出生体重和发育量表评分均无显著差异。但由于AOA可能无法完全模拟自然受精生理过程中的Ca2+周期性震荡和频率，其是否会改变Ca2+调控通路下游中特殊蛋白和酶的活性，是否会影响人类胚胎早期基因表达以及表观遗传学等，仍有待更多研究。

4.注射重组人PLCζ(recombinant human PLCζ，rhPLCζ)：向卵母细胞内注射rhPLCζ可以显著改善由于激活失败导致的ICSI-TFF。Nomikos等[33]将rhPLCζ蛋白注射到人卵和鼠卵中，都可以诱发自然受精激活样的钙振荡图谱，可有效激活卵子，激活鼠卵的囊胚形成率高达60%。而且，在由于PLCζ突变导致激活失败的人卵母细胞中，注入rhPLCζ还能起到“挽救”作用。Sanusi等[34]利用热处理后精子建立卵子激活失败的小鼠模型，比较了钙离子载体、Sr2+和rhPLCζ的激活作用，发现Sr2+和rhPLCζ能够获得更高的囊胚形成率，提示注射rhPLCζ可能为一种挽救ICSI-TFF发生和治疗ICSI-TFF的方法。但目前未见临床应用报道。

5.供精或供卵治疗：AOA失败可以依据鉴别原因予以供精或供卵治疗。

四、结语

ICSI-TFF临床上少见但处理困难。获卵数少、卵子形态和精子严重异常者具有较高的ICSI-TFF风险。发生ICSI-TTF后，应结合临床和实验室结果综合分析原因。对技术和随机因素导致的ICSI-TTF，可以通过改变临床促排方案提高卵子质量和增加获卵数，选择形态正常精子，ICSI操作时适当加强机械刺激等方法，以提高ICSI受精率，降低TFF的发生风险。对于原因不明OAF导致的ICSI-TTF，鉴别是精子因素或卵子因素有助于进一步的治疗选择和预后估计。对精子和卵子因素激活失败导致的ICSI-TTF，再次ICSI时结合AOA可以显著提高受精率、卵裂率和治疗结局。AOA对精子因素的ICSI-TTF的治疗结果更好。但AOA临床应用应有严格的指征，应在患者充分知情同意的基础上慎重使用。AOA的子代安全性仍需要长期随访的研究。