张光辉，邵小燕，严小敏

（重庆国联干细胞技术有限公司，重庆 401325）

近年来，随着肿瘤免疫学的发展，对于肿瘤的治疗，细胞免疫治疗已经成为继手术、放疗、化疗的第四种模式。常用的免疫细胞主要有细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells, CIK）、自然杀伤细胞（natural killer cells, NK）、树突状细胞（dendritic cells, DC）等[1]。CIK细胞是主要表达CD3+CD56+的一群淋巴细胞，而NK细胞主要表达CD3-CD56+。CIK、NK等细胞治疗是通过提取患者外周血的单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），在体外诱导扩增而制备所得[2]。大量的临床研究表明，CIK、NK具有提高肿瘤临床治愈率、减少肿瘤复发、改善生活质量、延长生存期等作用[3]。目前，体外诱导CIK和NK的技术都比较成熟，可以获得满足临床使用的细胞。但是，临床中所使用的细胞多为CIK或NK单独使用，联合应用进行治疗的较少，且联合应用对肿瘤细胞的杀伤功能缺乏报道。本研究通过采集肿瘤患者的外周血体外诱导扩增得到CIK和NK，对两种细胞联合应用对肿瘤细胞的杀伤功能进行检测。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至7月在重庆新桥医院所收治的10例肿瘤患者（均签署知情同意书），年龄43～68岁，平均年龄为（53.6±3.2）岁，其中男性6例、女性4例。其中肺癌3例，乳腺癌2例，胃癌2例，宫颈癌1例，肝癌1例，食管癌1例。所有患者在采集外周血15天内未接受放化疗。

1.2 实验材料

重组人白介素2（interleukin-2，IL-2，100万IU/瓶），购自北京四环生物制药有限公司；重组人白介素12（50 μg/支）、重组人白介素15（50 μg/支）、抗人CD3单抗（500 μg/支）、重组人γ-干扰素（100 μg/支），均购自北京同立海源生物科技有限公司；培养基（GT-T551，1 L/瓶），购自宝日医生物技术有限公司；淋巴细胞分离液（LTS1077，200 mL/瓶），购自天津灏洋生物制品科技有限公司；CD3-FITC（100tests/支）和CD56-APC（100tests/支），购自Biolegend公司；CCK-8，购自碧云天生物技术研究所；人慢性髓系白血病细胞K562细胞，购自中科院上海细胞生物研究所；T75、T225细胞培养瓶、移液管、离心管等无菌耗材，购自康宁公司；培养箱为赛默飞3111；离心机为艾本德5810/5810R；细胞计数仪为Nexcelom AUTOT4；流式细胞仪为BD Accuri C6；分析软件为BD Accuri CFLOW。

1.3 CIK、NK的细胞制备[4]

清晨饱腹后抽取患者外周静脉血50 mL于肝素钠采血管中，离心获取血清及全血细胞。收集血清经56 ℃水浴灭活30 min后，离心获取上清即自体血浆备用。全血细胞经生理盐水1∶1稀释后使用淋巴细胞分离液离心获取PMBC。PMBC重悬于含有10%自体血浆的培养基中，调整细胞密度为1.5×106个/mL。CIK细胞培养：添加抗人CD3单抗、γ-干扰素、IL-2。NK细胞培养：添加IL-2、白细胞介素-12、白细胞介素-15。细胞悬液移入培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。培养期间抽样计数，根据细胞生长计数情况进行补液扩瓶，控制细胞密度为1.0×106个/mL。

1.4 细胞纯度检测

分别取第14天的细胞悬液，离心重悬，调整细胞浓度为1.0×107个/mL，每管100 μL。CIK、NK细胞表型检测：分别加入抗体CD3-FITC、CD56-APC各2 μL，孵育20 min洗涤后行流式细胞表型检测，CIK检测CD3+CD56+细胞的比例，NK检测CD3-CD56+细胞的比例。

1.5 细胞杀伤活性检测

使用CCK-8检测试剂盒进行细胞杀伤活性的检测。取培养第14天的细胞悬液，离心后调整细胞密度为1.0×106个/mL，作为效应细胞。取对数生长期的人慢性髓系白血病细胞K562细胞，调整细胞密度为5.0×104个/mL，作为靶细胞。按照效靶比分别为5∶1、10∶1、20∶1的比例进行细胞混合，培养于96孔板内，每孔总体积2 mL。同时，设置效应细胞孔、靶细胞孔、空白对照孔，实验组为CIK组、NK组、CIK/NK联合组（1∶1）每组设3个复孔。置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养24 h后，加入CCK-8试剂20 μL，置入培养箱继续孵育4 h后于450 nm测定吸光度（A）值。按如下公式计算细胞杀伤活性：杀伤率=[1-（实验孔A值-效应细胞孔A值）∕靶细胞孔A值]×100%。

1.6 统计学处理

使用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量资料符合正态分布用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞的培养情况

培养的CIK、NK细胞第14天时，CIK细胞数量达到（5.3±1.2）×109（F=13.325，P=0.018，n=10），NK细胞数量达到（5.3±1.2）×109（F=15.428，P=0.016，n=10）。CIK细胞的纯度为（50.7±1.2）%（F=15.354，P=0.017，n=10），NK细胞的纯度为（46.3±4.7）%（F=16.337，P=0.018，n=10）。由细胞的数量和纯度来看，培养所得的CIK、NK细胞可以满足临床使用。

2.2 细胞杀伤活性检测

以培养第14天的细胞作为效应细胞，K562细胞为靶细胞，在效靶比5∶1、10∶1、20∶1下的杀伤情况为：CIK细胞组的杀伤率分别为（31.2±1.5）%、（42.7±2.1）%、（61.3±2.2）%，不同组间差异有统计学意义（F=16.724，P=0.016）。NK细胞组的杀伤率分别为（35.4±1.7）%、（46.2±2.3）%、（63.5±2.1）%，不同组间差异有统计学意义（F=13.521，P=0.015）。CIK/NK 1∶1联合组的杀伤率分别为（48.1±1.9）%、（61.3±2.5）%、（81.2±2.6）%，不同组间差异有统计学意义（F=16.432，P=0.018）。由此可见，CIK/NK联合应用对肿瘤细胞的杀伤率高于单独使用CIK和NK细胞。

3 讨 论

免疫细胞是人体发挥免疫功能的重要细胞，其通过血液、淋巴循环分布在免疫器官和组织中。CIK和NK细胞是进行肿瘤免疫治疗的两个重要部分。CIK是一群具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性及NK细胞的非主要组织相容性复合物（Major Histocompatibility Complex，MHC）限制性细胞，CD3+CD56+细胞是其主要的效应细胞。CIK细胞主要是以MHC限制性的方式杀伤靶细胞，DC细胞通过MHC限制性的方式抗原呈递给CIK细胞，以激活CIK细胞的杀伤效应，清除残存的肿瘤细胞而发挥更加强大的细胞毒性作用[5]。NK细胞是一群表达CD3-CD56+的淋巴细胞，NK细胞对肿瘤和病毒的识别无MHC限制性，不依赖于抗体，无需致敏就可以发挥杀伤肿瘤和病毒的功能[6]。NK细胞也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道防线。NK细胞还可分泌多种细胞因子，如穿孔素、细胞毒因子、TNF、IFN-γ、IL-2等来发挥免疫监视功能[7]。CIK细胞能够特异性的杀伤肿瘤细胞，但无法识别不表达MHC-I类分子的肿瘤细胞，而NK细胞能识别不表达MHC-I类分子的肿瘤细胞，并能杀伤肿瘤细胞，因此，两者的共同回输可对大部分肿瘤细胞进行有效杀伤[8]。

本研究采集了10例肿瘤患者的外周血，通过体外诱导扩增，获取CIK、NK细胞，并对其体外杀伤活性进行了检测。结果表明，体外培养可以获得满足临床治疗所需数量和纯度的细胞。对K562肿瘤细胞的杀伤效果来看，CIK、NK细胞联合应用高于单独使用，可以证实两者的共同作用不仅仅是两种细胞杀伤毒性的简单叠加，而是因为二者可相互促进各自的活化与免疫反应，显著提高机体的免疫反应。

本研究为CIK、NK细胞联合应用于肿瘤免疫治疗提供了体外实验依据，因而提示我们可以在临床上联合应用CIK和NK细胞进行肿瘤治疗，增强抗肿瘤活性，提高临床缓解率，改善患者生活质量。