田林奇 韩颖 魏聪 徐玉茵 周静 张娟丽 郭艳 河南省医疗器械检验所 （河南 郑州 450000）

内容提要： 目的：通过比较GB/T 14233.2-2005和GB/T 16886.5-2017中涉及的细胞毒性检测方法-MTT法的差异，为试验的选择提供参考。方法：分别采用GB/T 14233.2-2005和GB/T 16886.5-2017中的MTT法检测8种医疗器械的细胞毒性，比较两种方法对同一样品的结果判定是否存在差异。结果：由于两个标准在细胞浓度、培养时间、结果判定方面都有所不同，对同一种样品，可能会出现不同的判定结果。

随着现代科学技术的发展，医疗器械在全球范围内发展迅猛，大量新型的医疗器械产品得到了广泛的应用。但同时，因某些产品材质选用不当，或受加工残留剂的影响，对人体带来了一些不容忽视的生物学危害为了保障医疗器械在临床使用的安全有效，临床前的医疗器械生物学评价及评价方法的全球统一化引起了世界各国政府及生物学评价专家的高度重视，为此国际标准化组织于1989年正式成立了ISO/TCl94医疗器械生物学评价技术委员会，并相继制定颁布了ISO10993系列标准。这些标准已逐步为世界各国所认同并相继采纳。对于ISO10993系列标准，我国等同采用为GB/T 16886系列标准。

细胞毒性试验是医疗器械生物安全性评价的一个重要检测项目，并以其简便、快捷、灵敏性高、节省动物等优点均被列为首选试验项目，作为评价材料毒性的重要指标[1]。细胞毒性试验是将样品或样品浸提液与细胞共培养一段时间后，通过测定对L-929细胞生长和增殖的影响来评价样品对细胞的潜在毒性作用。目前我国医疗器械细胞毒性检测主要参照GB/T16886.5和GB/T14233.2-2005，而2018年7月1日起新实施的GB/T 16886.5-2017中，细胞毒性试验MTT法与GB/T14233.2-2005相比有了较大的变化。

在GB/T16886.5-2003中，只规定了几种评价方式，并没有规定具体的试验方法，而对于输血输注器具而言，一般采用的是GB/T14233.2-2005中的规定的MTT法。但在GB/T16886.5-2017中详细列举了几种细胞毒性检测的方法，具体有MTT法、XTT法、琼脂扩散法等。MTT法因毒性分级清晰，操作简单，灵敏度高，并可估算聚合物的IC50值，表现出了相对优势，所以被经常的使用[2]。但是GB/T16886.5-2017的MTT法与GB/T14233.2-2005相比具有很大的变化，主要表现在细胞浓度，培养时间，检测试剂，评价方法等。由于GB/T 14233.2-2005仍然现行有效，且此方法是之前对各类检品一直采用的通用的方法，因此，有必要对GB/T16886.5-2017和GB/T 14233.2-2005中所采用的方法进行比较，以便更好的评价医疗器械的细胞毒性[3]。

本试验通过分别采用GB/T 14233.2-2005和GB/T16886.5-2017中MTT法对4类8种具有代表性的医疗器械（涉及二类和三类器械）进行细胞毒性检测，以便为生产企业和检测部门进行体外细胞毒性试验的选择提供参考。

1.仪器与试剂

1.1 仪器

4131型二氧化碳培养箱（Thermo Fisher公司），T-DH型倒置显微镜（Nikon公司），Scepter型细胞计数仪（Millipore公司），Varioskan Flasg型全波长扫描读数仪（Thermo Scientific公司）。

1.2 试剂

L-929小鼠成纤维细胞株（中国科学院上海细胞所），胎牛血清（厂家：Gibco；批号：1912660C），MEM培养基（厂家：Gibco；批号：1897268），胰酶（厂家：Gibco；批号：1869828），DMSO（厂家：sigma；批号：RNBD8359），异丙醇（厂家：国药集团化学试剂有限公司；批号：20160217），MTT（厂家：sigma；批号：MKBN7264V）。

2.试验样品

医疗器械检品分别为不同厂家的麻醉面罩，导尿管，输液器，活检针等检品（本实验采用的检品均为上市前的产品）。

3.试验方法

3.1 供试液的制备

根据GB/16886.12的方法，由于选择的供试品均为不规则形状，按0.2g/mL的浸提比例浸提。使用含10%胎牛血清的细胞培养液，置于37°C浸提24h。

阴性对照品为PE，同等条件下制备。

阳性对照品溶液为含10%DMSO的细胞培养液，同等条件下制备。

3.2 GB/T 14233.2-2003方法

第1d，取对数生长期的细胞消化并加入细胞培养液，调节细胞密度为1×104/mL。

将配制好的细胞悬液接种96孔培养板，设空白对照、阴性对照、阳性对照和供试品组，每组各设6复孔，每孔接种100µL细胞悬液。置5%CO2培养箱37°C培养24h。

第2d，弃去96孔培养板内原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入PE浸提液，阳性对照组加入5%DMSO溶液，供试品组加入试验样品浸提液，每孔100µL，置CO2培养箱继续培养72h。

第5d，置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20µL质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入150µLDMSO，置振荡器上振荡10min，在酶标仪570nm和630nm波长下测定吸光度，按下式计算相对增殖率（RGR）。

式中：RGR：相对增殖率，%；A：供试品组（阴性、阳性组）吸光度；A0：空白对照组吸光度。

根据下表分级标准判定。阴性对照组的反应应不大于1级，阳性对照组至少为3级反应[4]。见表1。

表1. 细胞毒性反应分级

3.3 GB/T 16886.5-2017的方法

第1d，用0.25%胰酶将培养细胞从培养瓶中移出，细胞悬液在200g离心3min。用培养基重悬细胞悬液，调整密度为1×105个细胞/mL。将配制好的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔接种100µL。置5%CO2培养箱37°C培养24h。

表2. 试验结果

第2d，弃去96孔培养板内原培养液。每孔加入100µL含适当浓度样品浸提液、或阴性对照组、或阳性对照或溶剂（空白）的处理培养基，置CO2培养箱继续培养24h。

第3d，将培养板置显微镜下观察细胞形态。弃去孔内溶液，每孔加入50µL质量浓度为1g/L的MTT溶液，继续培养2h后弃去MTT溶液，加入100µL异丙醇溶液。震荡平板，在酶标仪570nm和650nm波长（参照波长）下测定吸光度。

活细胞减少导致了样品中代谢活性降低，这直接与生成的蓝紫色甲臜量有关，在570nm测量光密度，按下式比较计算存活率下降：

式中：OD570e：试样样品100%浸提液光密度平均值；OD570b：空白光密度平均值。

空白OD570平均值如≥0.2，则试验符合接受标准，如试验样品细胞存活率下降到＜空白的70%，则具有潜在的细胞毒性[5]。

4.结果

结果如下，两种方法的阴性浸提液和阳性浸提液均符合标准要求，供试品的具体结果如下，见表2。

可见，对于麻醉面罩，其材质多数为PVC，因此作为2类医疗器械，若采用GB/T14233.2-2005中的方法（即为GB/T16886.5-2003中经常采用的方法），反应等级为2级，可以判断为检品合格，若是采用GB/T16886.5-2017中的方法，由于检品原材料或是加工工艺的问题，其细胞增殖率达不到70%，则在结果判定中会判定为不合格，而输液器作为3类医疗器械，若采用GB/T14233.2-2005中的方法，其增殖率达不到80%，细胞等级达不到1级，对于三类医疗器械，一般要求细胞毒性为1级才会判定为合格，因此会判定为不合格，但是采用GB/T16886.5-2017中的方法，其细胞增殖率能够达到70%以上，因此可以判定为合格。同时，像橡胶类的导尿管这类检品，由于其细胞毒性大，两种方法的检品结果都为不合格，还有活检针之类的材质为不锈钢的检品，两种方法的结果都为合格。可以看到，检品本身的材质和加工工艺对细胞毒性的结果还是有很大的影响，同时，对于一些细胞毒性临近判定点的检品，两种方法也可能会出现不同的判定结果。这两种方法存在一定的差异性。

5.讨论

MTT比色法的原理：活细胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质，用DMSO将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度，从而定量测定细胞的存活比例。本试验通过采用2种体外细胞毒性检测方法，对4类8种不同器械的浸提液的细胞毒性进行检测，结果发现这两种标准在结果判定上存在一定的差异性，这可能是由于两个标准在细胞密度、培养时间、吸光度检测方法、评价方法上都有很大的区别。根据评审中心的一般要求，对于二类医疗器械，一般要求细胞毒性不大于2级细胞毒性可以接受，而对于三类的医疗器械，一般要求细胞毒性至少不大于1级。在GB/T 14233.2-2003的结果判定中，细胞增殖率不低于80%被认定为细胞毒性1级，增殖率不低于50%被认定为细胞毒性2级，而GB/T 16886.5-2017中增殖率达到70%即可判定为无细胞毒性，因此，实行GB/T 16886.5-2017对三类的医疗器械的要求放宽，而对二类的医疗器械的要求收紧。