程智超 王文浩

[摘 要]随着现代社会人类对糖的需求，甜菜在民间一直保持极高的地位，从欧洲中世纪起，甜菜便融人了当地人民的饮食生活中，并且十分盛行。目前甜菜在欧洲、美国等种植较多，选育研究也达到很高水平，但我国对甜菜的研究在很长的时间里基本上属于空白，仅因旅游业的发展及出口的需要，正逐年扩大甜菜的栽培面积，甜菜品种的选育工作也刚起步。为充分利用甜菜各种功能，本实验选取了糖根甜菜进行代谢组学定性和定量分析，采用高效液相色谱——串联质谱（UHPLC–MS/MS）技术对他糖根甜菜 5 份具有代表性的材料进行代谢产物分析，在负离子模式下共检测到了397个代谢物，利用非靶向代谢组学技术对的代谢谱进行分析发现了糖根甜菜的营养成分，明显为一步研究甜菜的营养成分和营养功能提供了基础。

[关键词]糖根甜菜;代谢组学;营养成分

[中图分类号]S917.3 [文献标识码]A

1 概述

甜菜中除含有宏量营养素糖类、蛋白质、脂肪外，还有包含其他不同种类的微量营养素，例如烯酸、核苷酸、氨基酸、维生素这些微量营养素是甜菜特质性营养的分子基础。甜菜的主要产品是糖，作为糖料作物开展的科学研究，至今仅有200多年。但目前食用甜菜在欧洲、美国等的选育研究也达到很高的水平，育成一批具有丰产抗病、高蛋白、中糖、高色素、低氮、低纤维等优良性状的食用甜菜品种。

甜菜同时具有比例合理的钙、镁，及可以帮助人体更好利用钙的硼，且其高钾低钠的特性对高血压患者是很有利的。1.对抗肿瘤;2.降脂保肝;3.降压作用;4.生长刺激;5.保胃治肝。现阶段，利用甜菜收获期次生代谢产物分析，更倾向于鉴别国外进口品种。对于国产甜菜血源及其他栽培种甜菜覆盖面较小。因此原有标记一方面缺少科学性验证，另一方面局限了可以鉴定的品种范围。本研究的开展能够为未来甜菜营养价值的确定提供更加科学准确的依据。

随着生物物理学以及生物信息学领域的不断发展，代谢组学作为研究生物体内所有小分子代谢物的综合性分析手段，其目的是开展生物系统中所有小分子代谢物进行全面整体、动态分析，更准确地确定代谢物动态变化。基于对甜菜代谢物的定性定量分析，代谢组学可以用于研究代谢途径或代谢网络的解析，不同生物个体的代谢组學表型现象，不同疾病、药物等物理、化学或病原生物刺激后代谢产物的应答机制，以及食品、药物等安全评价。

2 材料与方法

2.1 主要试剂与材料

甲醇（LC-MS级），乙腈（LC-MS级），醋氨酸（LC-MS级），氨水（LC-MS级）均购买于CNW Technologies。L-2-氯苯丙氨酸（≥98%）购买于上海恒柏生物科技有限公司。

2.2 代谢组测定分析

2.2.1 代谢物鉴定与定量

由黑龙江大学农作物研究院提供的代表性质资源，所有糖根甜菜均在相同繁育基地相同条件种植，待植株完全成熟后收获移取100μL样本至1.5ml EP管中，加入300μL甲醇，再加入20μL内标，涡旋混匀30秒;超声10min（冰水浴）;零下20℃ 静置一小时;将样本放置4℃，13000rpm离心15min;小心地取出200μL上清于2mL进样瓶，每个样本各取20μL混合成QC样本，再取200μL上机检测。将磨样进行粉碎，至于磨口玻璃样品瓶中保存在冰箱中通过质谱特征结合保留指数的方法对甜菜进行定性分析，对质谱分析后的代谢物数据进行预处理，并基于自建数据库及其他公共数据库，对质谱检测的一级谱二级谱数据进行定性分析，得到样本表达的代谢物组分信息。然后对所有代谢物质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正，对代谢物进行定量。

2.2.2 代谢物分析

对比糖根不同实验组的之间的代谢物，采用ANOVA、T-test等检验方法进行差异分析。差异判断标准为差异倍数大于2，且P value<0.05。得到糖根甜菜代谢物，对其理化性质进行分析。

2.2.3 代谢物KEGG富集分析

生物体中的复杂代谢反应及其调控并不单独进行，往往由不同基因和蛋白质形成复杂的通路和网络，它们的相互影响和相互调控最终导致代谢组发生系统性的改变。对这些代谢和调控通路的分析可以更全面，更系统的了解实验条件改变导致的生物学过程的改变，性状或疾病的发生机理和药物作用机制等生物学问题。利用KEGG代谢通路富集分析并通过MBRole（http：//csbg.cnb.csic.es/mbrole2/）获取代谢物的KEGG ID。

3 结果与分析

测定的糖根甜菜代谢组学数据用系统自带软件Analyst 1.6.1进行数据处理，采用MRM模式采集二级数据对代谢物进行定量分析。最终获得糖根甜菜中代谢物结构和含量信息，对397个代谢物进行了定性分析，推断出33个代谢物可能的结构。

利用鉴定397个代谢物的代谢网络分析发现，基于液相色谱质谱联用的非靶向代谢组可覆盖：磷酸合成，嘌呤代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，5（s），14（R）-脂蛋白B4和对氯苯基丙氨酸代谢，N-乙酰-L-苯丙氨酸和α-N-乙酰L-谷氨酰胺代谢等33条代谢路径，基本覆盖了KEGG中常见次生代谢物的代谢路径，为发掘糖根甜菜营养成分打下很好的基础。

4 讨论

本章采用GC-MS非靶向代谢全谱分析方法对糖根甜菜进行了研究。GC-MS非靶向代谢全谱分析通过XCMS自动提取到397离子的33个代谢物含量信息，主要包括游离的氨基酸、脂肪酸、磷酸、甘油、脂肪酸、糖类或醇等。为进——步研究糖根甜菜的特质性营养功能提供基础。

[参考文献]

[1] 卢秉福.耿贵.周艳丽.食用甜菜的开发应用[J].中国糖料，2008（02）.

[2] 黄晓荣.基于代谢组学的黑芝麻黑花生营养成分挖掘与识别研究[D].中国农业科学院，2017.

[3] 吴谦.基于多种分析技术的肺癌代谢组学研究[D].上海交通大学，2014.

[4] 张会敏.古井贡酒微生物群落结构及其与主要风味物质的关联研究[D].哈尔滨工业大学，2017.

[5] 彭可垄.复方盐酸吡格列酮格列美脲临床药代动力学[D].华中科技大学，2011.

[6] 彭可垄.子宫内膜异位症芳香化酶P450基因表达及其临床意义[D].广州医学院，2002.

[7] 张然然，王磊，李洋，等.基于代谢组学技术的鹿血与鹿茸血鉴别研究[J].畜牧兽医学报2018（07）.

[8] 贾遂宾.基于小波的基因差异表达建模分析[D].哈尔滨工业大学，2015.

[9] 付旭平.基因芯片数据分析[D].复旦大学，2005.

[10] López-Ibá?ez J， Pazos F， Chagoyen M. MBROLE 2.0—functional enrichment of chemical compounds[J].Nucleic acids research，2016： gkw253.

[11] 王艳.铁皮石斛与炭疽菌互作机制的初步探讨[D].广州中医药大学，2017.

[12] 池毓斌.榄果实品质特性及其代谢组学的初步研究[D].福建农林大学，2017.

[13] 何昀潞.基于稳定同位素标记--质谱技术对吸烟者与非吸烟者血浆羧酸类差异代谢物的研究[D].中国烟草总公司郑州烟草研究院，2018.