宋俊科，邢逞，龚宁波，张雯，孙加琳，吕扬，杜冠华

(中国医学科学院北京协和医学院药物研究所1.天然药物活性物质与功能国家重点实验室；2.药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室；3.晶型药物研究北京市重点实验室，北京 100050)

多晶型是固体有机化合物普遍存在的一种现象，药物晶型的差异不仅影响药物物质成分的稳定性，而且会影响药物的治疗效果[1-3]。来曲唑(letrozole)是新一代芳香化酶抑制剂，为人工合成的苄三唑类衍生物，其通过抑制芳香化酶，使雌激素水平下降，从而消除雌激素对肿瘤生长的刺激作用[4-6]。来曲唑存在多种晶型[7]，比较不同来曲唑晶型之间的药动学特点，对于保证药物的临床疗效具有重要意义[8]。笔者在本实验建立SD大鼠血浆中来曲唑含量测定的反相高效液相色谱法，并分析不同晶型来曲唑经消化道固体给药后大鼠体内药动学的差异。

1 材料与仪器

1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级SD大鼠，雄性[9-11]，体质量230～270 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(京)2006-0009。

1.2药品与试剂 来曲唑晶型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(Ⅲ为无定形态)由中国医学科学院药物研究所吕扬教授提供(含量≥99%)，3种晶型固体物质的粉末X射线衍射图谱见图1。卡马西平(中国医学科学院药物研究所药物分析室制备，含量≥99%)，甲醇(色谱纯，Fisher)，乙腈(色谱纯，Fisher)，纯净水(娃哈哈公司)。

1.3仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；Eppendorf离心机(德国Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2漩涡混匀器(上海凡劲仪器设备有限公司)；Eppendorf移液器(德国Eppendorf公司)。

2 方法与结果

2.1溶液的配制

2.1.1对照品溶液的配制 精密称取来曲唑对照品1 mg，加入甲醇充分溶解并混匀，配成1 mg·mL-1来曲唑母液，然后以流动相依次稀释成不同浓度的标准溶液。

A.来曲唑晶型Ⅰ；B.来曲唑晶型Ⅱ；C.来曲唑晶型Ⅲ(Ⅲ为无定形态)

图1来曲唑3种晶型固体物质的粉末X射线衍射图谱

A.Letrozole crystal form Ⅰ； B.Letrozole crystal form Ⅱ； C.Letrozole crystal form Ⅲ (amorphous form)

Fig.1PowderX-raydiffractionspectrogramofthreeletrozolecrystalforms

2.1.2内标溶液配制 精密称取卡马西平1 mg，加入流动相1 mL充分溶解并混匀，配成1 mg·mL-1卡马西平母液，以流动相稀释成100 μg·mL-1的内标溶液。

2.2色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(40：60)；流速：1 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：239 nm；进样量：20 μL[12-15]。

2.3血浆样品处理

2.3.1空白血浆处理方法 精密吸取大鼠空白血浆100 μL，置于1.5 mL离心管中，加入乙酸乙酯800 μL，震荡3 min，12 100×g离心10 min，取上层有机相，在室温下氮气(N2)吹干，用流动相100 μL复溶，震荡3 min，12 100×g离心10 min，进样20 μL。

2.3.2血样处理方法 精密吸取大鼠血浆100 μL，置于1.5 mL离心管中，加入内标工作液10 μL，涡旋混匀。然后按照“2.3.1”中方法处理，进行HPLC分析。

2.4专属性考察 在实验所采用的HPLC条件下，来曲唑和卡马西平的保留时间分别为7.9和6.0 min，见图2。来曲唑和内标峰形良好，在保留时间范围内均没有内源性物质或其他物质的干扰，基线噪音较小，可满足定量测定要求。

A.空白血浆；B.空白血浆配制标准样品；C.给药大鼠血浆样品；1.卡马西平；来曲唑

图23种血浆样品的HPLC图

A.bank plasma；B.blank plasma spiked with letrozole and IS；C.rat plasma sample after oral administration of letrozole spiked with IS；1.carbamazepinz；2.letrozole

Fig.2Typicalchromatogramsofthreekindsofplasmasamples

2.5标准曲线的绘制及最低定量限的确定 分别配制来曲唑浓度为0.25，0.5，1.25，2.5，5，6.25，12.5，25，50 mg·L-1的系列血浆，按照“2.3”项血样处理方法处理样品，在相应色谱条件下进行测定，重复5次，以来曲唑峰面积(As)与卡马西平峰面积(Ai)的比值(Y)对来曲唑浓度(X)作线性回归，得标准曲线：Y= 0.24X-0.006 4，R2=0.999 5(n=9)，表明来曲唑在0.25～ 50 mg·L-1内线性关系良好。本方法定量限为0.25 mg·L-1，此浓度下信噪比大于10，并且其与加样浓度比较的偏差在±20%范围内。

2.6萃取回收率 分别配制来曲唑浓度为0.5，5和50 mg·L-1的血浆样品，按照“2.3.2”项下血样处理方法处理，进行HPLC分析，记录峰面积，计算萃取回收率。重复5次，结果见表1。来曲唑在3个浓度条件下回收率分别为100.87%，93.30%和102.41%，其RSD分别为3.14%，7.26%和5.90%，表明本法提取回收率良好，适合目标化合物的测定。

表1 来曲唑在大鼠血浆中的回收率

Tab.1 Recovery of letrozole in rat plasma

表1 来曲唑在大鼠血浆中的回收率

药物加样浓度/(mg·L-1)回收率RSD%来曲唑0.5100.87±3.173.14593.30±6.777.2650102.41±6.045.90卡马西平5094.07±2.772.94

2.7精密度和准确度实验 分别配制来曲唑浓度为0.5，5和50 mg·L-1血浆样品，按照“2.3.2”项下的血样处理方法处理，进行HPLC分析。结果见表2。来曲唑测定的日内精密度RSD<4.75%，日间精密度RSD<5.68%，日内准确度偏差的绝对值<4.84%，日间准确度偏差的绝对值<2.12%，提示该方法准确、可靠、重复性好，符合新药临床前药动学研究生物样品定量分析的要求。

表2 来曲唑在大鼠血浆中的精密度与准确度

Tab.2 Intra-day and inter-day accuracy and precision of letrozole in rat plasma

表2 来曲唑在大鼠血浆中的精密度与准确度

加样浓度/(mg·L-1)日内精密度测定浓度/(mg·L-1)RERSD%0.50.48±0.02-4.844.7554.98±0.12-0.422.505052.30±1.514.602.89加样浓度/(mg·L-1)日间精密度测定浓度/(mg·L-1)RERSD%0.50.51±0.021.203.5954.89±0.18-2.123.615049.51±2.81-0.975.68

2.8稳定性实验 为考察来曲唑的稳定性，将配制好的血浆样品分别在自动进样器放置12 h、室温放置4 h、30 d内冻融3次、和-20 ℃冻存30 d后再进行测定，从而确定测定方法的稳定性。结果见表3。各处理条件的分析结果RE均在±15%范围内，表明方法稳定性较好。

表3 方法稳定性考察

Tab.3 Stability test of the method

表3 方法稳定性考察

处理条件与加样浓度/(mg·L-1)测定浓度/(mg·L-1)RERSD%自动进样器放置12 h 0.50.57±0.0214.832.75 55.39±0.117.812.04 5053.52±1.047.031.95室温放置4 h 0.50.56±0.0212.312.99 55.32±0.136.312.47 5054.81±2.479.624.51冻融3次 0.50.56±0.0311.185.38 55.33±0.146.682.70 5054.83±2.499.674.55-20 ℃冻存30 d 0.50.54±0.068.6111.75 55.33±0.136.602.51 5054.92±2.469.834.48

2.9药动学研究 将18只SD大鼠随机分为3组，每组6只，于给药前12 h禁食不禁水，按100 mg·kg-1固体灌胃，于给药后0.5，1，2，3，5，6，7，9，12，14，24，30，37，48 h于眼内眦取血置肝素化管中，离心取上清液100 μL，然后按照“2.3.2”处理方法处理后，进行测定并绘制药-时曲线，见图3。利用药动学统计分析软件DAS 3.0.7，采用非房室模型进行药动学参数的计算并采用one-way ANOVA进行统计分析，结果见表4，大鼠灌胃来曲唑晶型Ⅰ、晶型Ⅱ和晶型Ⅲ后，血液中来曲唑Cmax分别为(9.247±4.612)，(23.387±9.049)和(15.682±1.589) mg·L-1，AUC0→t分别为(198.115±47.014)，(476.641±125.467)和(271.817±41.068) mg·L-1·h。

3 讨论

本实验通过对大鼠灌胃来曲唑晶型后血药浓度进行监测，得到各个晶型药动学参数。来曲唑晶型Ⅱ、Ⅲ的Cmax较晶型Ⅰ分别高156%和78%，晶型Ⅱ的AUC0-t和AUC0-∞较晶型Ⅰ和Ⅲ分别高141%，77%和75%，103%，说明口服来曲唑晶型Ⅱ可能会有更好的体内吸收情况，有效血药浓度更高。另外，晶型Ⅰ平均滞留时间(MRT0-t和MRT0-∞)较晶型Ⅱ和Ⅲ分别高5%，33%和82%，219%，可能是由于晶型Ⅰ的吸收比较滞后，导致其初始血药浓度较低和末端血药浓度较高，最终造成MRT增大。此外，晶型Ⅰ表观分布容积(Vz)高于晶型Ⅱ和Ⅲ，分别高333%与167%，这也可能与其吸收滞后的效应相关，或存在其他未知的影响因素。清除率结果显示，与晶型Ⅱ比较，晶型Ⅰ和晶型Ⅲ分别高114%与101%，这提示晶型Ⅱ相比其他晶型清除率更低，这也从侧面解释其血药浓度最高的原因。以上研究结果表明，不同来曲唑晶型口服给药后，AUC0-t、AUC0-∞和Cmax存在着一定的差异，其中晶型Ⅱ可能为来曲唑的优势晶型。

表4 SD大鼠灌胃来曲唑多晶型(100 mg·kg-1)后药动学参数

Tab.4 Pharmacokinetic parameters after oral administration of letrozole crystal forms (100 mg·kg-1) in rats

表4 SD大鼠灌胃来曲唑多晶型(100 mg·kg-1)后药动学参数

晶型AUC0-tAUC0-∞(mg·L-1·h)Ⅰ198.115±47.014∗1319.468±217.254∗2Ⅱ476.641±125.467564.812±111.664Ⅲ271.817±41.068∗1277.817±42.301∗1晶型MRT0-tMRT0-∞hⅠ20.058±4.57250.514±63.902Ⅱ19.148±5.15327.676±24.623Ⅲ15.085±1.98316.011±2.529晶型t1/2tmaxhⅠ30.193±43.9714.500±7.688Ⅱ10.749±13.35215.833±10.61Ⅲ7.266±1.3589.167±1.602晶型Vz/F/(L·kg-1)CLz/F/(L·kg-1·h)Cmax/(mg·L-1)Ⅰ10.391±7.208∗20.392±0.15∗19.247±4.612∗1Ⅱ2.444±2.3930.183±0.03423.387±9.049Ⅲ3.845±0.9340.368±0.06∗215.682±1.589

与晶型Ⅱ比较，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with crystal form II，*1P<0.01，*2P<0.05