姚淑敏，郭 倩，王 萍，陈 珊，宋晴晴，徐凯峰

（曲阜师范大学 生命科学学院，山东 曲阜 273165）

利用耐受性酵母生产乙醇在成本和便利性方面具有一定的优势，如耐酸酵母在酸性条件下（pH＜4）发酵产乙醇可最大限度地减少细菌污染的风险和降低消毒的成本[1-3]。另外，酵母对盐的耐受性（如硫酸钠）也是工业生产生物乙醇和酿酒业的重要研究内容之一。产乙醇酵母菌包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非酿酒酵母（non-Saccharomyces），国内外对酿酒酵母的乙醇、酸、盐、糖胁迫已有广泛的研究[4-8]。大多数酿酒酵母能在pH 2.5～8.5生长，但它们属于嗜酸性生物，在酸性条件下生长会更好，其生长的最适pH范围为pH 4.0～6.0。在葡萄酒酿造期间，酿酒酵母常在发酵开始阶段受到低pH胁迫。非酿酒酵母对环境胁迫的耐受性研究，主要集中在对一些毕赤酵母（Pichia pastoris）、假丝酵母（Candida）和汉森酵母（Hansenula polymorpha）的研究[9-10]。LIC等[11]研究毕赤酵母A16对金属锌的耐受性，结果表明，毕赤酵母A16可以在0.5 mmol/L锌环境中去除96.09%的锌；LIC等[12]研究毕赤克鲁维酵母（Pichia kluyver）对多种盐和高温的耐受性，结果表明，毕赤克鲁维酵母可以在44 ℃和0.1 mol/L KNO3、Na2SO4以及0.2 mol/L的NaCl、KCl、NaNO3、K2SO4、MgCl2条件下正常生长，生长量达到3.64 g/L。

研究发现有些种类的东方伊萨酵母比酿酒酵母具有高的耐受性，如耐高温、耐酸碱等[13-16]，因此在工业发酵生产生物乙醇和丁二酸上有着极其重要的地位[17]。MIAO Y等[16]利用高通量转录组对东方伊萨酵母耐乙醇的能力进行研究，结果表明，东方伊萨酵母耐受10%vol乙醇。KOUTINASM等[15]研究发现，东方伊萨酵母菌MF-121在含高浓度硫酸钠的酸性介质（pH=2.0）中或在高温（温度为43℃）条件下能够产生大量的乙醇，具有较好的耐受性。

前期实验已对分离自甜酒酿的东方伊萨酵母FJ-J-3进行了耐乙醇、耐高温的研究[18]，发现菌株FJ-J-3能够耐受16%vol的初始乙醇含量，但是不能耐高温。为了进一步了解菌株FJ-J-3对环境条件的耐受性，对该菌株进行了pH和硫酸钠（Na2SO4）的耐受性研究，为菌株发酵生产乙醇的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

东方伊萨酵母菌（Issatchenkia orientalis）FJ-J-3：本实验室分离自甜酒曲。

1.1.2 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培养基[19]：葡萄糖20 g，酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，琼脂粉32 g，蒸馏水定容至1 L，115℃灭菌15 min。

液体YPD培养基：YPD培养基中不加琼脂粉。

发酵培养基：葡萄糖20 g，酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，蒸馏水定容至1 L，115℃灭菌20 min。

胁迫发酵培养基：葡萄糖50 g，酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，蒸馏水定容至1 L，115 ℃灭菌15 min后，用H2SO4和NaOH调培养基的pH值分别为2.0、4.0、6.0、8.0。在不同pH条件下分别配制Na2SO4含量分别为2%、4%、6%的培养基，以不加Na2SO4的培养基为对照。

1.1.3 试剂

酵母浸出粉（生化试剂）：英国OXOID公司；蛋白胨、葡萄糖（均为生化试剂）：北京鸿润宝顺科技有限公司；硫酸钠（Na2SO4）（分析纯）：上海影佳实业发展有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-2010气相色谱（gas chromatography，GC）仪（配带氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）、微机工作站、RTX R-5色谱柱（30 m×0.32 mm×0.5μm））：日本岛津公司。GN-9080隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；HNY-2102c恒温培养振荡器：天津欧诺仪器股份有限公司；H.H.S-214B电热恒温水浴锅：上海医疗器械股份有限公司；H2050R台式高速冷冻离心机：湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；UV-5500可见光分光光度计：上海元析仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将保藏的东方伊萨酵母菌（Issatchenkia orientalis）FJ-J-3解冻后，划线于YPD固体培养基上，28℃条件下培养24 h后重复活化一次。在活化好菌种的培养基上挑取单菌落特征明显的I.orientalis FJ-J-3接种于装有25 mL YPD液体培养基的100 mL锥形瓶中，于28℃、170 r/min条件下培养至OD600nm值=0.4时，10 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，弃上清，用5 mL无菌水洗涤菌体两次并制备OD600nm值=1.0的种子液。

1.3.2 pH及盐胁迫对酵母菌生长的影响

取1 mL种子液分别接种于16种YPD胁迫发酵培养基中，装液量为25 mL/100 mL，于28℃、170 r/min条件下培养，每隔12 h定时取样测定I.orientalis FJ-J-3的OD600nm值和乙醇含量。

1.3.3 测定方法

菌体生物量：利用分光光度计法，在波长600 nm处测定其吸光度值。

乙醇含量：按照参考文献[20]的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 pH为2.0条件下不同盐含量对菌株FJ-J-3的影响

当培养基pH=2.0时，东方伊萨酵母FJ-J-3在不同的Na2SO4的含量培养基中的生长状况及乙醇含量结果见图1。

图1 菌株FJ-J-3在p H为2.0的不同Na2SO4含量培养基中的生长曲线（A）及乙醇含量（B）Fig.1 Growth curve(A)and ethanol content(B)of strain FJ-J-3 in medium with pH 2.0 and different Na2SO4 contents

由图1A可知，在培养基pH=2.0的条件下，菌株FJ-J-3在不含Na2SO4的对照组培养基中生物量最大，OD600nm值达到4.87；随着Na2SO4含量的增加细胞生长越慢，在含有6%Na2SO4的盐培养基中，菌株FJ-J-3的生长严重受到抑制，最大OD600nm值=2.3。由图1B可知，在培养基pH=2.0的条件下，Na2SO4含量会影响菌株FJ-J-3发酵产乙醇，Na2SO4含量越高，乙醇产量越低。即当Na2SO4含量为0、2%、4%、6%时，菌株FJ-J-3培养到60 h时乙醇产量分别为1.3%vol、1.1%vol、0.79%vol、和0.4%vol。由此可见，菌株FJ-J-3在pH=2.0的培养基中Na2SO4盐耐受较弱。

2.2 pH为4.0条件下不同盐含量对菌株FJ-J-3的影响

当培养基pH=4.0时，东方伊萨酵母FJ-J-3在不同的盐含量培养基中的生长状况及乙醇含量结果见图2。

图2 菌株FJ-J-3在pH为4.0的不同Na2SO4含量培养基中的生长曲线（A）及乙醇含量（B）Fig.2 Growth curve(A)and ethanol content(B)of strain FJ-J-3 in medium with pH 4.0 and different Na2SO4 contents

由图2A可知，菌株FJ-J-3在培养基pH=4.0的条件下，当Na2SO4含量为2%时，菌株FJ-J-3的OD600nm值最大，且最大OD600nm值为26.5；对照培养基中菌株FJ-J-3的最大OD600nm值为24.1；当Na2SO4含量为4%、6%时，菌株FJ-J-3的最大OD600nm值分别为23.2、21.3。由此得出，菌株FJ-J-3在偏酸（pH=4.0）的环境中生长良好，且在这种环境中，菌株对盐的耐受性增加，即使在6%盐含量的情况下菌株仍能旺盛生长，说明一定的酸可以增加菌株对盐的胁迫的耐受性。

由图2B可知，菌株FJ-J-3在培养基pH=4.0的条件下，当培养基中Na2SO4含量为2%时，菌株FJ-J-3的乙醇产量最大，在发酵36 h时乙醇产量达到最大（2.99%vol），而对照组、Na2SO4含量分别为4%、6%的条件下乙醇产量则分别为2.54%vol、2.27%vol、2.02%vol。由此得出，在偏酸（pH=4.0）的环境中少量的盐可以促进菌株发酵产乙醇，而高浓度的盐对菌株的乙醇发酵有一定的影响。

2.3 pH为6.0条件下不同盐含量对菌株FJ-J-3的影响

当培养基pH=6.0时，东方伊萨酵母FJ-J-3在不同的盐含量培养基中的生长状况及乙醇含量结果见图3。

由图3A可知，当培养基pH=6.0时，菌株FJ-J-3的生长状况受盐浓度影响较小。当Na2SO4含量为6%时，菌株FJ-J-3生长最好，最大OD600nm值为27.5；对照组的最大OD600nm值为24.3；当Na2SO4含量为2%、4%时，菌株FJ-J-3的最大OD600nm值分别为22.6、21.2。因菌株FJ-J-3的最佳生长pH为6.0，因此在这种环境中菌株的生长受盐胁迫的影响较小，这种最佳的pH使得菌株能够耐受较高的Na2SO4含量。

由图3B可知，在pH=6.0的培养基中，当Na2SO4含量为6%时，菌株FJ-J-3的乙醇产量也最高，达到2.93%vol；对照组中菌株FJ-J-3的最高乙醇产量达到2.55%vol；当Na2SO4含量为2%、4%时，菌株FJ-J-3的最高乙醇产量分别为1.97%vol、1.76%vol。说明在pH=6.0的条件下，菌株FJ-J-3对Na2SO4的耐受性增加。

图3 菌株FJ-J-3在pH为6.0的不同Na2SO4含量培养基中的生长曲线（A）及乙醇含量（B）Fig.3 Growth curve(A)and ethanol content(B)of strain FJ-J-3 in medium with pH 6.0 and different Na2SO4 contents

2.4 pH为8.0条件下不同盐含量对菌株FJ-J-3的影响

当培养基pH=8.0时，东方伊萨酵母FJ-J-3在不同的盐含量培养基中的生长状况及乙醇含量结果见图4。

由图4A可知，当培养基pH=8.0时，菌株FJ-J-3的生长受到一定的影响，在前12 h菌株生长缓慢，分析原因可能是由于培养基的碱性，导致菌株不能很快进入生长阶段，需要一段时间的适应和调整。12 h以后菌株逐渐适应环境，进入生长期，然而菌株的生长量与pH=4.0和pH=6.0环境的生长量仍然有所不同。当Na2SO4含量为2%时，菌株FJ-J-3的OD600nm值最大，为20.9；其次为对照（OD600nm为18.6）。当Na2SO4含量为4%和6%时，菌株FJ-J-3的最大OD600nm值分别为17.9和15.4。由此可见，在6%盐浓度培养基中菌体的生长受影响较大。这说明偏碱的环境菌株对盐的耐受性减弱。

由图4B可知，由于菌体生长受到影响，所以在培养基pH=8.0时，菌株FJ-J-3在不同盐浓度培养基中的乙醇产量也受到影响。菌株FJ-J-3在Na2SO4含量为2%的培养基中乙醇产量高于其他3组，乙醇产量最高达到2.34%vol。由此得出，在偏酸或偏碱的环境中，少量的盐可以提高菌株发酵产乙醇的能力。

图4 菌株FJ-J-3在pH为8.0的不同Na2SO4含量培养基中的生长曲线（A）及乙醇含量（B）Fig.4 Growth curve(A)and ethanol content(B)of strain FJ-J-3 in medium with pH=8.0 and different Na2SO4 contents

3 结论

该研究对东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）FJ-J-3的pH、盐耐受性进行了研究。结果表明，东方伊萨酵母FJ-J-3对环境胁迫有一定的耐受性，当pH为2.0、不含Na2SO4时，OD600nm值（4.8）和乙醇产量（1.3%vol）最高；当pH为4.0、Na2SO4含量为2%时，OD600nm值（26.5）和乙醇产量（3.0%vol）最高；当pH为6.0、Na2SO4含量为6%时，OD600nm值（27.5）和乙醇产量（2.9%vol）最高；当pH为8.0、Na2SO4含量为2%时，OD600nm值（20.9）和乙醇产量（2.3%vol）最高。在pH=4.0和pH=6.0培养条件下具有较好的盐耐受性，在pH=2.0和pH=8.0的条件下，菌株FJ-J-3对盐的耐受性减弱。本研究为菌株发酵生产乙醇的进一步开发利用提供理论依据。