林文珊 周添标

汕头大学医学院第二附属医院肾内科（广东汕头 515041）

近年来肾脏替代治疗的相关研究受到国内外学者的关注。腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）治疗的优势在于花费低、对残余肾功能的保护［1］、对血流动力学影响小等［2］。但随着PD治疗的进行，患者腹膜出现腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelial cells，PMCs）缺失、上皮细胞-间充质转分化（epithelial mesenchymal transdifferentiation，EMT）等表现，引起腹膜超滤功能进行性丧失，导致患者终止PD治疗。

1 腹膜纤维化的诊断标准

腹膜纤维化（peritoneal fibrosis，PF）与硬化之间无明显界限［3］，ZHOU等［4］提出了从生化标志物、组织病理及腹膜功能三方面来确立PF诊断。他建议使用参与PF过程的CA125、IL⁃6等生化标志物用作PF早期诊断及预后评估；病理活检可作为诊断PF的金标准：其病理特点主要为PD治疗后腹膜出现间皮层消失、间皮下致密区增厚、血管透明样变和血管生成。此外，采取纵向腹膜功能研究可帮助诊断PF，包括追踪测定腹膜超滤量是否丧失、葡萄糖等小溶质转运能力是否增加等。

2 PF发生发展机制

2.1 致PF的因素及相关机制

2.1.1 非生理性腹透液传统腹透液中高级糖基化终产物（advanced glycosylation end products，AGEs）、葡萄糖降解产物（glucose degradation products，GDPs）、高浓度葡萄糖、低PH值和高渗透压等非生理性因素长期作用于腹膜，抑制了PMCs增殖活性和引起间皮-间充质转分化（mesothelial mesenchymal transdifferentiation，MMT）［5］。一项病例对照研究发现相同糖负荷下，与使用生物不相容腹透液相比，应用低非生物相容透析液后PF程度轻于前者［6］。高糖本身可直接诱导促纤维化因子表达增多［7］和抗纤维化因子表达减少［8］，另外，透析液的热杀菌作用和活性氧的刺激也可使葡萄糖代谢产生GDPs和AGEs，后者可激活AGE受体，引起血管细胞粘附分子-1、转化生长因子-β1（trans⁃forming growth factor⁃β1，TGF⁃β1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等过表达，导致炎细胞聚集以及腹膜新血管生成等一系列促PF反应［9］。

2.1.2 氧化应激常规腹透液可产生ROS，可导致腹膜高转运、腹膜增厚、血管生成等情况［10］。作为机体维护自身平衡和自我保护的机制，细胞自噬可降低机体ROS和炎症因子水平，当机体平衡失调时可引起高活性物质蓄积、脂质过氧化和DNA损伤，导致间皮细胞凋亡、炎症分子增加，促进纤维化的发生［11-12］。

2.1.3 低氧由于腹膜长期经受着腹透液的非生理刺激，腹膜组织处于缺氧环境中，低氧诱导因子α1（hypoxia in⁃ducible factorα1，HIF⁃α1）的表达增多。杨军等［13］发现在PD患者中，HIF⁃α1表达与PD龄长短、TGF⁃β1及VEGF水平正相关，这说明细胞缺氧是介导PF进展和腹膜超滤衰竭机制之一。

2.1.4 肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin⁃angiotensin⁃aldosterone system，RAAS）醛固酮不仅可通过介导ERK激活从而诱导活性氧产生，还能通过p38 MAPK通路诱导PMCs发生EMT［14］。前肾素结合其受体后通过MAPK途径介导TGF⁃β1的表达［15］，后者被PMCs识别后，进而又促进细胞内酸性细胞器运输、分泌纤维连接蛋白和可溶性前肾素受体，即TGF⁃β1正反馈促进前肾素与受体结合，导致TGF⁃β1过表达，诱导纤维化的发生［16］。

2.1.5 腹膜炎症细菌、真菌等生物感染所致的腹膜炎及非生理性腹透液和尿毒症本身的毒性作用引起的长期微炎症状态，皆是腹膜纤维化的重要促成因素。LI等［17］用巨噬细胞清除剂将实验小鼠体内的巨噬细胞清除后再使用腹透液，发现该组腹膜形态学能保持相对稳定，α⁃SMA表达明显降低，E⁃cadherin表达明显增加，而注入M1和M2巨噬细胞后再使用腹透液发现，与M2巨噬细胞组和无巨噬细胞对照组相比，M1组表现组织损伤和ECM沉积最严重，腹膜超滤功能下降最明显，这说明M1型巨噬细胞在促纤维化方面更为重要。KITTERER等［18］用实时定量荧光PCR分别测定了非尿毒症患者、未进行腹膜透析的尿毒症患者（pPD）以及已进行腹膜透析的尿毒症患者的NFAT5 mRNA、CCL2 mRNA，并用免疫荧光法测定检测NFAT 5、CCL2、NF⁃κB p50、NF⁃κB p65和CD 68的蛋白表达，发现尿毒症患者NFAT5 mRNA水平较非尿毒症对照组升高，而进行PD治疗与否并未对结果产生影响。该研究结果提示与健康对照者相比，pPD具有诱导NFAT5表达增加的趋势，并可能通过NF⁃κB上调PD患者腹膜CCL2的表达，促进CD68+单核-巨噬细胞的迁移和浸润。

2.2 细胞水平的改变及相关机制

2.2.1 EMTEMT是指上皮细胞转分化为间质细胞，发生细胞外基质堆积的过程。在PF的发生发展中，TGF⁃β1是EMT的核心诱导因子，具有介导细胞外基质生成和沉积、诱导血管生成、促进炎细胞浸润等作用［19］。

2.2.2 TGF⁃β1/Smads依赖通道TGF⁃β1与TGF⁃β1 Ⅱ类受体（TβRⅡ）结合使后者发生构象改变而被TβRⅠ识别，三者共同形成的TβRⅡ⁃TGF⁃β1⁃TβRⅠ复合物激活下游分子Smad蛋白［20］——磷酸化的受体激活型（R⁃Smads）与共同通路型（Co⁃Smads）结合，促进胞内信号转导过程；而抑制型（I⁃Smads）则竞争性抑制R⁃Smads与TβRⅠ结合，负性作用于TGF⁃β1/Smads通路的信号转导过程［21］。有研究发现实验敲除Smad3基因的小鼠仅有少量细胞外基质沉积且未见Smad2/3表达，而敲除Smad2基因的小鼠表现出比对照组更明显的腹膜厚度增加、大量细胞外基质沉积以及TGF⁃β1的高表达［22］。该实验证明了Smad3在促进PF发生发展中发挥关键作用，同时也证明了Smad2与Smad3在促PF机制中作用完全不同。在赵华等［21］的实验研究中，不仅TGF⁃β1、p⁃Smad2/3在应用葡萄糖氯己定构建的大鼠PF模型中表达水平升高，Smad7的表达也增多；给予褪黑素治疗后大鼠PF的程度减轻，此时测得Smad7表达水平下降，考虑Smad7与TGF⁃β1/Smad通路或存在反馈机制。

2.2.3 TGF⁃β1/Smads非依赖通道MAPK通道为Smad非依赖通道的重要内容，包括磷脂酰肌醇-3激酶（PI3k）、细胞外信号调节激酶（ERKs）和Akt等多种信号转导途径［23］。分别在不同时间点往TGF⁃β1处理后的大鼠晶状体上皮中加入等量体外神经生长因子抑制剂UO126，ERK 1/2激活所引起的EMT虽被有效阻断，但阻断ERK 1/2信号仅能在TGF⁃β1诱导EMT的起始阶段中起作用，而不能逆转EMT的发展［24］。彭翔等［25］在体外构建TGF⁃β1诱导小鼠 PMCs转分化模型时发现Akt磷酸化水平增加，且与TGF⁃β1剂量相关；而在使用PI3K/Akt抑制剂后，TGF⁃β1引起的EMT相关蛋白和基因的改变得到明显逆转，这证明了PI3K/Akt信号参与EMT的发生。

ZHU等［26］发现Notch信号的成分Jagged⁃1、Notch⁃1以及Notch的下游靶点HES⁃1 mRNA水平在大鼠TGF⁃β1诱导的PF模型中均明显升高，提示Notch途径可能是TGF⁃β1的下游通路。

有研究发现HSP47可促进胶原蛋白、α⁃SMA的表达和巨噬细胞浸润，参与促进高糖诱导的PF发展［27］。YANG等［28］用AGEs建立小鼠EMT模型，对比分析了转染HSP 70⁃cDNA基因和用siRNA沉默HSP 70基因表达后的EMT改变情况，发现HSP 70过表达不仅可抑制TGF⁃β/smads通路还可抑制细胞外高活性物质产生和p⁃ERK的表达，改善AGEs诱导的EMT程度，而HSP70的低表达则促进了EMT的发展。实验发现TGF⁃β1也可通过TLR⁃4依赖通道介导淋巴管生成，发挥致PF的作用［29-30］。

2.2.4 腹膜间质细胞缺失腹膜组织病理显示，非生理相容性透析液引起的PF伴有PMCs脱落、缺失［11］。曹东维等［31］进行的体外实验通过比较PMCs传代数量、检测细胞增殖和细胞周期情况以及测量端粒长度等细胞衰老相关特征性改变，发现透析液可诱导PMCs发生早衰。KSIAZEK等［32］发现PMCs早衰时线粒体膜电位降低和活性氧增加，DNA双链断裂标志物γ⁃H2AX焦点过表达，端粒长度未发生改变而端粒酶活性降低，说明氧化应激使PMCs基因组非端粒区域的DNA双链断裂损伤加速细胞衰老发生。此外，氧化应激还可造成线粒体损伤、凋亡因子释放，引起细胞凋亡［33］。SHIN等［34］发现内质网应激对腹膜间质细胞具有双重反应：阻断抑或提前诱导内质网应激发生均能改善TGF⁃β1诱导的细胞凋亡情况。这说明内质网应激实为细胞的一种适应性反应，而当应激强度超出细胞能承受的适应时，EMT发生和PMCs凋亡将不可避免。

2.3 基因调控

表观遗传是研究不涉及碱基对序列改变而具有稳定传递特性的遗传信息变化的一门学科。最近的研究表明，纤维化过程也受表观遗传机制的调节，如肝脏纤维化疾病与DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA（non⁃coding RNA，ncRNA）等的表达水平关系密切［35］。

2.3.1 微小RNA（microRNA，miRNA）miRNAs为ncRNA中的一类，可在转录后水平对mRNA进行调控，从而影响细胞形态和功能。近年来许多研究均证实了miRNAs参与了PD相关性腹膜纤维化，可分为促纤维化miRNAs如miR⁃NA⁃15b、miRNA⁃21等，以及抗纤维化 miRNAs如 miR⁃NA200c、miRNA29b、miRNA⁃30a等［36，38］。MA 等［37］分别检测腹透患者透析流出液中、miRNA⁃21抑制剂转染PMCs和小鼠PF模型中腹膜的miRNA⁃21以及纤维化相关指标的表达，发现miRNA⁃21促进PF的进展。CHE等［39］证明了mRNA转录启动子区域的Carg盒可为血清应答因子（SRF）作用靶点，后者的激活能促进PMCs中含Carg盒的miRNA⁃199 a/214基因簇的转录，下调E⁃cadherin和Claudin⁃2的表达，促进PMCs发生EMT。

2.3.2 长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）LIU等［40］测定了正常腹膜与PDF诱导PF的小鼠模型腹膜232个lncRNA、154个mRNA以及15个miRNA的表达。与正常腹膜相比，纤维化腹膜各类lncRNAs、mRNAs、miRNAs均有高表达或低表达的情况；信号通路分析提示PF与JAK⁃STAT、MAPK等信号通路有密切关系；基因共表达网络分析揭示了lncRNA、mRNA、miRNA的多种关系，如lncRNA与mRNA相关、mRNA与miRNA相关。此外还发现了lncRNAs和miRNAs可以共同调节一个mRNA。该研究不仅综合分析了小鼠PF模型和正常对照组的lncRNA、mRNA和miRNA的差异性表达，还探索了表观遗传参与PF的相关信号通路，以及lncRNA、mRNA和miRNA三者作用关系，但对这些基因差异表达的研究仍需进一步深入并加以诠释其具体机制。

2.3.3 DNA甲基化/去甲基化KIM等［41］发现DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）诱导的RASAL1高甲基化降低了大鼠RASAL 1蛋白的表达水平，腹膜TGF⁃β1表达升高，腹膜间皮基质层厚度明显增加；而给予DNMT抑制剂5⁃氮杂胞苷干预则可改善PF程度。研究发现，一些miRNAs可抑制DNMT的转录，如miRNA⁃29是DNMT⁃3a和DNMT⁃3b的直接调节剂等，导致蛋白质编码基因的去甲基化和转录激活，从而促进了基因的表达，另一方面DNMTs在调控某些miRNA表达方面也起着关键作用［42］。

2.3.4 组蛋白乙酰化/去乙酰化YANG等［43］进行体外实验发现高糖诱导EMT时，PMCs组蛋白H3组分发生乙酰化反应，而组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransaferase，HAT）抑制剂C646能通过阻断TGF⁃β1/Smad3信号通路逆转EMT。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）可分为4类，其中传统观点认为，Ⅰ类（HDAC1/2/3/8）和Ⅱ类（HDAC4/5/6/7/9/10）与肿瘤的进展和预后有关，最近研究发现Ⅰ类和Ⅱ类HDAC也与PF相关。IO等［44］在大鼠PF模型中发现Ⅰ类HDAC拮抗剂SAHA可抑制Smad通道和相关促纤维化因子如CTGF mRNA的表达，上调组蛋白乙酰化水平及抗纤维化因子如BMP⁃7 mRNA的表达，并发挥抗炎和抗血管生成作用，从而发挥抗PF作用。而XU等［45］在小鼠PF模型中应用HDAC6的特异性拮抗剂tubastatin A或HDAC6 siRNA也可减少STAT 3和NF⁃κB p65的磷酸化水平升高、表皮生长因子受体的过表达等促纤维化活动，改善巨噬细胞向损伤腹膜的浸润，减轻PF反应。

2.3.5 组蛋白甲基化/去甲基化MAEDA等［46］使用组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）甲基转移酶G9a的抑制剂可减低流出液中TGF⁃β1的水平和流出液中PMCs数量，改善胶原蓄积及单核细胞浸润情况。这说明H3K9甲基化为PF的机制之一。

3 PF治疗进展

3.1 大体水平

3.1.1 改变传统腹透液成分CUENCA等［47］在尿毒症小鼠模型中使用低GDP的碳酸氢钠/乳酸缓冲透析液，观察到CD4+、IL⁃17+细胞数量较少，PF和血管生成被抑制，这表明中性PH值、低糖降解产物的腹透液更有利于腹膜完整性的保存。在一项随机对照试验［48］中发现艾考糊精进行PD治疗时能有效改善腹膜超滤功能损伤，减轻液体超负荷，但同时也有发生无菌性炎症的可能。氨基酸型腹透液能更好地维持PMCs的生理功能，但同时也可能会导致代谢紊乱［49］，如含有L⁃精氨酸的氨基酸透析液可诱导间皮生成NO从而引起相关血管效应等［50］。

氨基胍能消除GDPs、减少AGEs生成，并抑制一氧化氮的促血管生成作用，其在PF治疗作用在大鼠模型中得到证明［51］。吡哆胺也被证明能减少大鼠模型AGEs蓄积，改善腹膜功能和结构［52］。

KIHM等［53］在尿毒症大鼠PD模型中，应用苯磷硫胺处理后，大鼠肾脏和腹膜AGE及RAGE的表达降低，肾小球和肾小管间质损伤减少，腹膜运输特性有明显的改善，这提示苯磷硫胺具有保护PD和尿毒症大鼠残肾和腹膜功能的作用。

3.1.2 抗炎及免疫调节故调节免疫手段的应用在PF治疗上也备受关注。塞来昔布在腹膜超滤衰竭大鼠模型中的应用能明显降低前列腺素E2水平、抑制血管和淋巴管生成、改善腹膜间皮形态学和腹膜超滤功能异常［54］。PMCs受腹透液影响可产生损伤相关模式分子，后者被TLR识别并介导无菌炎症。RABY等［55］发现采用TLR抑制剂可溶性TLR 2或敲除TLR 2/4基因等措施均可抑制促炎因子和促纤维化因子的释放，这表明TLR⁃DAMPs或为治疗PF的潜在靶点。吗替麦考酚酯可缓解腹膜炎症状态、减少新血管生成，还可抑制基质合成，促进基质降解，防止细胞外基质收缩硬化，发挥抗纤维化作用［56］。

3.1.3 其他针对致纤维化大体水平上的治疗据报道，低分子肝素或可通过抑制HIF⁃1α、VEGF、TGF⁃β1从而改善腹膜功能［57］。WAKABAYASHI等［58］发现予大鼠口服抗氧化剂虾青素能抑制PF的发展，甚至可预防腹膜损伤，其机制是虾青素通过抑制炎症和氧化过程从而发挥抗血管生成及降低腹膜TGF⁃β1、Snail mRNA和α⁃SMA的表达的作用。应用ACEI/ARB可降低促纤维因子TGF⁃β1和PAI⁃1等的表达［59］，减少腹膜胶原纤维沉积［14］，故ACEI/ARB可作为预防PF发生的治疗。

3.2 细胞水平

3.2.1 抑制EMT过程LI等［60］发现抑制核心岩藻糖基化（一种TβR翻译后修饰）可通过阻断TGF⁃β1和PDGF信号通路减轻大鼠PF程度，因此阻断核心岩藻糖基化可能是治疗PF药物开发的潜在靶点。WANG等［61］分别在大鼠腹膜出现损伤时与发生纤维化时给予吉非替尼，结果提示吉非替尼不仅可预防PF的发生，还能中止纤维化进展。多种生长因子抑制剂苏拉明可通过抑制TGF⁃β1信号传导、炎症浸润和血管生成，有效地减轻腹膜纤维化的发展［62］。LEE等［63］在动物模型中发现VitD可抑制α⁃SMA过表达和E⁃cadherin低表达，并降低减轻氯己定诱导的腹膜形态和功能异常。因此，药物使用所带来的副作用及不良反应不容忽视。

3.2.2 保护PMCs夏阳阳等［33］发现使用丹参酮ⅡA能有效抑制细胞氧化应激作用，并下调PMCs凋亡因子表达，从而表现出对腹膜的保护作用。研究发现硒可降低腹膜间皮细胞中ROS的生成，抑制ROS/MMP⁃9信号通路激活和PI3K/Akt信号级联反应，减轻EMT程度［64］。高糖透析液可通过持续性诱导腹膜细胞发生依赖Beclin⁃1自噬而引起凋亡和纤维化，而使用siRNA抑制Beclin⁃1自噬后TGF⁃β1表达减少［65］。

3.2.3 细胞疗法将来源于PD患者腹透液中的上皮细胞样（Epi）细胞和成纤维细胞样（Fib）细胞分别移植到小鼠PF模型受损的壁层和脏层腹膜上，发现移植Epi细胞组的腹膜未见无明显粘连，壁腹膜和脏腹膜无增厚，促纤维化因子表达降低；而移植Fib细胞组则相反［66］。这提示间皮细胞移植或有潜在治疗前景，但仍需进行更完善的实验设计。此外，来自于骨髓、脂肪组织［67］或人脐带血［68］的间充质干细胞在移植到腹膜后改善了PF组织学表现［69］。SHEN等［70］从不同透析龄的不同患者PD流出液中均分离出同一种表型造血干细胞，该来源的干细胞的腹腔定植能力比脐血来源者更强。

3.3 基因水平早前已有TGF⁃β1的致纤维化作用可被腺病毒介导的核心蛋白聚糖基因转染抑制的相关报道［71］。然而，腺病毒载体在受体中只产生短暂的基因表达，因此需重复多次注入才可获得持续性或高浓度目的基因表达。然而，腺病毒载体的高免疫原性可引起强烈的炎症反应，甚至可为致命性，这限制了腺病毒进一步在临床上的应用［72］。CHAUDHARY等［73］建立酵母多糖诱导的PF大鼠模型研究对比了未予治疗及分别用金纳米粒和腺病毒介导的核心蛋白聚糖基因治疗PF的效果。与未予治疗组相比，使用基因治疗的两组大鼠PMCs表型改变明显减少，TGF⁃β1、α⁃SMA等水平明显降低。

对目的基因转录水平和转录后水平修饰的调节也可能成为治疗PF的潜在治疗方法。增加外源性抗纤维化ncRNAs或促进其表达、沉默促纤维化ncRNAs等措施在动物实验中取得了成效［38，44］，但在临床中的应用及推广则需要大量的安全性检测和进一步的人体试验。

3.4 其他SOUSA等［74］提出把腹透患者暂停≥1个月PD治疗和将腹透临时转为血透以给予腹膜休息的方法可保护腹膜功能，发现腹膜休息可逆转腹膜异常功能状态，但需在腹膜功能尚且可逆时起作用，这强调了早期应用腹膜休息治疗。一项关于包裹性腹膜硬化的多中心研究发现他莫昔芬能延长腹膜硬化患者生存时间［75］。另外，中药制剂对PF的治疗作用也值得期待和探讨，如柴胡可通过抑制氧化应激和巨噬细胞浸润减轻PF程度［76］；黄芪可抑制单核/巨噬细胞的募集和活化，从而降低透析腹膜中TGF⁃β1的产生，明显改善腹膜间皮下上皮细胞层的纤维化和腹膜厚度［77］等。

4 展望

PF的发病机制主要包括腹膜炎损伤、尿毒症的自毒作用以及非生理性腹膜透析。PD相关性PF发生最关键的是TGF⁃β1因子的激活，但具体的分子机制尚未明确。随着对PF发病机制的探索的进一步深入，防治的手段愈来愈多，如调整腹透液成分、抑制TGF⁃β1作用、保护间皮细胞、使用基因治疗、调节免疫功能、移植干细胞等。然而需要注意的是，临床上仍未有治疗PF的有效药物。上述措施大多处于实验研究阶段，就算有少部分已应用于临床，但仍缺乏大样本数据分析和足够的循证医学证据；因此对PD相关性PF的研究还需要不懈深入，继续寻找有效、安全的防治方法。