陈沙娜 特格喜白音 敖登其木格 王海荣

【摘 要】 荧光碳点（FCDs）是一种新型的碳纳米颗粒，具有良好的分散性和荧光稳定性。这种FCDs有特殊的光学特性和优良的生物学性质使其在生物医学的光学影像和肿瘤诊断治疗方面具有突出的优势和良好的发展前景。碳元素在医药领域发挥着重要作用，其中传统蒙药“灰剂”中的炭药就是典型的例子。蒙药炭药黑冰片在蒙医中有悠久的使用历史并疗效显著，黑冰片通过无氧锻炼之后碳化成为生物炭，可以制备出荧光碳点。通过模拟黑冰片在人体胃肠道中消化吸收的过程，并成功合成绿色、经济、水溶性强的光致荧光碳点。本次研究对蒙药纳米药的研究提供理论依据。

【关键词】 荧光碳点;黑冰片;碳纳米颗粒;纳米药

【中图分类号】 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）23-0000-00

碳元素作为自然界最重要的元素之一，参与了整个地球的组成与活动，在人体中也是重要的组成部分。碳元素在医药领域中发挥着重要作用，其中传统蒙药“灰剂”中的炭药就是典型的例子。炭药是将蒙药饮片、动物药或矿物药经过无氧煅烧成生物炭，然后磨成细粉入药服用，最终这些药经过胃肠道消化成碳元素进入五脏六腑发挥作用。炭药通常在临床上用于治疗食道、胃肠道疾病或肿瘤等疾病疗效显著。蒙医应用炭药治疗疾病有着悠久的历史，多年来不断地研究和探索它的功能。近年来，由碳元素构成的各种碳纳米材料（Carbon Nanomaterials， CNMs）逐渐成为21世纪科技创新的研究热点。其中，包括碳纳米管、纳米颗粒、纳米纤维、氧化石墨烯和碳点（Carbon Dots，CDs）等都引起了极大的关注[1-4]，其广泛应用于太阳能电池、生物成像、光催化、纳米电子器件、光动力学治疗和生物医疗等领域[5，6]。碳点（CDs）作为新型荧光碳纳米材料，具有类似量子点优良的光致发光性能，同时具有化学惰性和良好的生物相容性。根据文献了解到CDs 对组织和器官不会引起任何异常或损伤，并没发现急性毒性、亚急性毒性及基因毒性等。有研究比较了碳点、单壁碳管、二氧化硅和氧化锌的细胞毒性与基因毒性后发现，碳点的毒性最低[2，5]。

目前，碳点的制备方法有合成方法、电化学方法、激光消融法、强酸溶解法、水热一步法等等很多种[7-9]，可是，没有一种方法能够说明蒙药和中药等传统炭药在人体里正常消化和吸收并起到药理作用的过程。因此本课题组经过努力研究新的制备荧光碳点的方法，那就是酶切法，拟制备出蒙药特色炭药黑冰片的荧光碳点。本方法的优点是主要模拟黑冰片在人体胃肠道里消化吸收的过程并激发后发生荧光。通过该方法制备的碳点，其表面富含官能性有机基团，使得其具有较好的分散性和水溶性，亦可非常便捷地对黑冰片荧光碳点进行功能化修饰和生物偶联标记;同时也有非常好的生物形容性。

据文献了解到，近年一些研究者们利用姜、生物秸秆、咖啡炭、鸡蛋清、蜡烛灰、石墨烯等分别作为原料用不同的方法制备出CDs[10-13]，并发现所制备的CDs具有非常好的抑制肝癌、人肺癌、人乳腺癌、人宫颈癌细胞的生长和抗氧化作用，对正常乳腺上皮细胞和小鼠肝细胞具有低毒性。我们逐渐意识到荧光碳点是个潜在的可以突破传统蒙医药的创新研究的新的亮点。

综上述，本项目利用蒙药黑冰片荧光碳点的良好发光性质以便进一步将其应用于蒙医药研究领域及其治疗胃肠道肿瘤的重大疾病的诊断治疗研究。然后利用荧光碳点的光致发光性质，基于某些蒙药能引起黑冰片荧光碳点光致发光信号的变化来实现该药物的检测和跟踪，从而建立简单、快速、灵敏的检测药物的方法和标准，并利用荧光颗粒的光致发光性质，跟踪或检测黑冰片颗粒对细胞与体内做出的影响。本研究对炭药的研究以及蒙医药的研究具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料與仪器 电热鼓风干燥箱（重庆航亚试验仪器有限公司，中国）或马弗炉（北京西尼特电炉有限公司，中国）;U-3010紫外-可见分光光度计（日立公司，日本）用于碳点溶液吸收光谱的测定;F-2500型荧光分光光度计（日立公司，日本）用于测定荧光激发与发射光谱;碳点的水合粒径及表面电荷由Zetasizer Nano （马尔文仪器有限公司，英国）测定; 透射电子显微镜（TEM），用于测定合成碳点的元素组成和C Is光谱，Spectrum GX傅立叶转换红外光谱仪（Perkin Emer公司，美国），碳点的荧光寿命通过FL-TCSPC荧光光谱仪（乔平伊冯公司，法国）测定。

1.2 制备C-dots

1.2.1 模拟人胃、肠液的配制：  ①胃液的配制：0.2g NaCl， 0.32g 胃蛋白酶， 0.7mL 浓盐酸， 双蒸馏水定容于100mL。pH 约为1.2。（胃蛋白酶购自于Sigma 公司。胃蛋白酶的活力为2330U/mg pro）。②模拟肠液的配制：将0.68g KH2 PO4 溶于25mL 双蒸水， 振荡， 完全溶解后加19mL 0.2mol/L NaOH 和40mL 的双蒸水。加胰蛋白酶1.0g，混匀， 用0.2mol/L NaOH 调pH 到7.5±0.1， 双蒸水定容于100mL[4]。（胰蛋白酶购自于Sigma 公司。胰蛋白酶的活力为10010U/mg prot。）

1.2.2 黑冰片荧光颗粒的制备实验 本次荧光颗粒的制备通过三步进行：首先，将1g黑冰片碳粉投入到在预先加入模拟人胃液的圆底烧瓶中，置于油浴锅中37℃、磁力搅拌回流12h。反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋（MWCO1000）在超纯水中透析 2～3 天（期间不断换水），直到 pH 值接近中性。透析处理后的黄色液体再逐级离心分离提纯，最后以16000 转/秒离心30min后提取上清液4℃保存。其次，将胃液消化离心沉淀的黑冰片碳颗粒回收，并倒入适量超纯水轻轻混匀然后16000 转/秒离心 10min。以上方法重复两次，最后把沉淀物溶于肠液置于油浴锅中37℃、磁力搅拌回流 12h。反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋（MWCO1000）在超纯水中透析 2～3 天（期间不断换水），直到 pH 值接近中性。最后以16000 转/秒离心30min后提取上清液4 ℃保存。然后，两次提取的黄色上清液混合后经旋转蒸发浓缩至 25mL 左右。接着把浓缩的液体放入微波炉以50Hz微波5min后放入冷冻干燥机干燥，然后加入适量超纯水干燥碳颗粒里超声1min后回收，在荧光检测仪下检测发荧光等情况后4℃保存。

2 表征分析

透射电子显微镜（TEM） 技术可以直接获得样品的三维图像，根据图像分析可以直接得到颗粒的三维尺寸。使用FEI Tecnai G2 Spirit在120kV的加速电压下进行透射电子显微镜（TEM）。 使用Nano ZS90 Zetasizer（MRW11-ltx3200a）测定ζ电位。 在室温下分别在UV-2550UV-vis分光光度计（Shimadzu，Japan）和Luminescence Spectrometer 55（Perkin-Elmer）上记录吸收和荧光光谱。 在Burker Vector 22光谱仪上记录傅里叶变换红外（FTIR）光谱。

3 结果与讨论

3.1 C-Dots的特征和性质 黑冰片为猪科动物野猪（Susscrof.aL）的干燥成形粪便的炭化物， 蒙药名为哈日-嘎布日（Har Gabur）， 是蒙药成方常用药之一，具有健胃、助消化等功效。主要治疗胃肠疾病最有特色的炭药材，与其它药材配伍用于多种配方。野猪的杂食动物，只要能吃的东西都吃，包括各种草药、果实、根、昆虫、鸟蛋、大家鼠、腐肉，甚至也会吃野兔、蛇等。野猪对毒素有一定的免疫力，而且肠道免疫力特别强，有很多免疫蛋白和消化酶。野猪碳化粪中包含很多药材碳化物，也包含很多肠道免疫蛋白和酶等。我们通过模拟蒙药炭药黑冰片在人体胃肠道里消化吸收的过程中制备出黑冰片纳米荧光颗粒。图1显示透射电子显微镜（TEM） 技术直接获得的C-Dots三维图像。图1根据图像分析可以直接得到颗粒的三维尺寸。通过HRTEM和XRD表征了碳点的形态和结构。Cdots的XRD测量显示了一个宽峰位于2θ的大约26°，通常25.8°为石墨烯的特征峰。样品的峰与石墨烯的特征峰接近。

3.2 荧光碳点在不同波长近红外激发光下的发射光谱图 碳点的特性之一是吸收激发光电子，电子发生跃迁，转变成激发态电子，激发态电子能量释放过程中通常会发出荧光或磷光，这是荧光产生的基本原理。碳点随着激发光的波长不同，发出的荧光颜色和强度也不同。图2给出的不同激发光下的碳点的荧光发射光谱图。激发光从400nm 增加到550nm 时，荧光强度随之增加，荧光峰也发生红移;当继续增加激发光的波长时，虽然荧光发射峰红移，但是发射强度随之急剧下降，说明了此裸碳点在550nm激发有最强的荧光发射峰。

3.3 碳点的表面成分分析 通过HRTEM的EDS光谱分析和XRD表征了碳点的形态和结构。Cdots的XRD测量显示了一个宽峰位于2θ的大约26°，通常25.8°为石墨烯的特征峰。样品的峰与石墨烯的特征峰接近。在透射电镜圆形代表区域的EDS光谱分析峰中0.33，0.56处出现两个强峰，分别为归于碳、氧。因此，所制备的碳量子点的主要元素成分是C（26.88%），O（14.56%），（见表一）。EDS光谱表征实验表明，样品中以C、O 元素为主。根据HRTEM的EDS光谱分析和XRD分析结果样品中含有石墨烯（GO）的结构。

4 结论

本实验利用酶切法成功制备出了黑冰片荧光纳米碳点（CDs），更重要的是：我們认为此法与黑冰片在人体里的消化和吸收具有密切的相关性，甚至会直接影响其药理作用。我们在研究中发现用酶切方法制备出的黑冰片荧光碳点（CDs），其表面富含羟基、氨基等官能性有机基团，使其不仅具有良好的分散性和水溶性（传统碳点难溶于水），而且易于功能化修饰和生物偶联标记，同时还有良好的生物相容性。我们课题组在这基础上进一步对黑冰片荧光纳米碳点的生物医药方面临床应用研究，对其毒副作用的更加全面、客观的评价，而且测定碳点对机体免疫功能的影响。碳点在改进生物传感器、医学成像设备、蒙药纳米治疗、药物靶向输送等领域都有非常好的应用前景。

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（收稿日期：2019-06-26 編辑：刘 斌）