查中萍 万丙良 殷得所 杜雪树 李进波 夏明元 戚华雄 李圆梦

摘要：针对转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻（Oryza sativa L.）TT51-1及其回交后代中外源基因的检测建立了一种三引物多重PCR检测方法。结果表明，三引物PCR体系可以准确区分cry1Ab/cry1Ac基因纯合、杂合和阴性三种基因型，纯合体中只扩增出一条298 bp片段，阴性材料中只扩增出一条787 bp片段，杂合体中同时扩增出298 bp片段和787 bp片段。该体系的建立为利用TT51-1进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便有效的基因鉴定技术。

关键词：转基因水稻;多重PCR;cry1Ab/cry1Ac;TT51-1;华恢1号

中图分类号：S511         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）24-0232-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.056           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

A tri-primer multiplex PCR method for the detection of exogenous genes in the cry1Ab/cry1Ac transgenic rice TT51-1

ZHA Zhong-ping1，WAN Bing-liang1，YIN De-suo1，DU Xue-shu1，LI Jin-bo1，

XIA Ming-yuan1，QI Hua-xiong1，LI Yuan-meng2

（1.Food Crop Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Key Laboratory of Crop Germplasm and Genetic Improvement，Wuhan 430064，China;2.College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract： A tri-primer multiplex PCR method was established for the detection of cry1Ab/cry1Ac gene in the cry1Ab/cry1Ac transgenic rice TT51-1 and its backcross progenies of Huahui No.1. According to the foreign gene sequence inserted in TT51-1 and the rice genome sequence on the left and right sides of the insertion site， three PCR primers P1， P2 and P3 were designed. The results showed that the three primers PCR system could accurately distinguish the homozygous， heterozygous and negative genotypes of cry1Ab/cry1Ac gene. Only one 298 bp fragment was amplified in homozygote and only one 787 bp fragment was amplified in negative materials. Both 298 bp and 787 bp fragments were amplified from the heterozygote. The establishment of this system provides a simple and effective gene identification technique for molecular breeding of borer-resistant rice using TT51-1.

Key words： transgenic rice; multiplex PCR; cry1Ab/cry1Ac; TT51-1; Huahui No.1

稻縱卷叶螟、二化螟和三化螟是水稻（Oryza sativa L.）的主要害虫，其危害会造成叶片枯白、枯心苗、白穗，瘪谷大量增加，严重影响水稻产量。转Bt毒蛋白基因水稻对稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟具有良好的抗性，种植Bt水稻既可以有效避免稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟对水稻的危害，又可以减少杀虫剂的使用，减轻环境污染。水稻科学家们已经培育出一系列Bt基因水稻[1-4]，这些Bt水稻为培育抗螟虫水稻新品种提供了种质资源。转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻华恢1号是华中农业大学培育的无标记基因抗虫转基因水稻品系，该品系已获得国家转基因水稻安全证书，同华恢1号的无标记基因株系为TT51-1。国家转基因生物新品种培育重大专项实施以来，现有数十个国家级及省级研究机构和高等院校以TT51-1作为抗虫水稻育种的基因供体亲本，优良常规水稻品种（品系）作受体亲本进行杂交（回交）选育，在选育过程中利用分子标记对抗虫基因进行跟踪，从而选育出抗螟虫的优良水稻新品种（品系）。目前所用的检测cry1Ab/cry1Ac基因的分子标记主要是根据导入的外源基因片段序列设计的特异显性标记，该标记只能检测目标基因的有无，不能区分杂合基因型和纯合基因型，需要在下一代对基因型进行验证，因此显性标记检测效率低、耗费时力。多重PCR标记可以有效鉴别杂合基因型和纯合基因型，提高选择效率，加快育种进程[5-7]。

本研究根据TT51-1中插入的外源基因左侧水稻基因组序列设计一个正向引物P1，根据插入位点右旁侧水稻基因组序列设计一个反向引物P3，在插入的外源基因序列靠近左侧水稻基因组处设计一个反向引物P2。利用三引物进行多重PCR扩增，在非转基因水稻和纯合转基因水稻中分别扩增出大小不同的一个片段，在转基因杂合体中同时扩增出两个片段。因此该体系可以鉴定出转基因纯合、转基因杂合和转基因阴性三种基因型，为利用TT51-1进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便有效的基因鉴定技术。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  水稻材料  转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻TT51-1（纯合系）由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室/国家植物基因研究中心（武汉）提供。非转基因水稻R650由湖北省粮食作物种质资源创新与遗传育种重点实验室保存。

以非转基因水稻R650母本，TT51-1为父本进行杂交，获得cry1Ab/cry1Ac基因杂合的F1代，F1代与R650回交获得BC2F1代，分子标记检测阳性单株继续回交获得BC3F1代，根据分子检测和农艺性状考察结果，在BC3F1代中收获阳性单株20株。种植20个BC3F1单株的种子获得BC3F2群体，对该群体单株进行三引物PCR检测，选择30个Bt阳性单株收种并種植该30个单株种子成30个BC3F3株系，通过三引物检测获得外源基因纯合的株系。

1.1.2  试剂  DNA提取和PCR检测试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2  方法

1.2.1  DNA提取  取1～2 cm长的水稻幼嫩叶片置于2 mL圆底离心管中，加入2×CTAB 400 μL后在QIAGEN Tissue lyser样品研磨仪中磨碎匀浆，置60 ℃水浴20 min，加入400 μL氯仿/异戊醇（24∶1）震荡混匀10 min，10 000 r/min离心10 min，取200 μL上清置于另一加有400 μL 95%预冷乙醇溶液的1.5 mL离心管，静置10 min，13 000 r/min离心10 min，弃上清后晾干，加入50 μL灭菌的超纯水溶解。

1.2.2  三引物设计  在转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻TT51-1中T-DNA靠近右侧水稻基因组处设计一条正向引物P1，序列为5-ataataccgcgccacatagc-3。T-DNA序列左侧水稻基因组序列中设计一条正向引物P3，序列为5-tcttccctagggcaaagtca-3;在T-DNA序列右侧水稻基因组序列中设计一条反向引物P2，序列为5-aaaaacagagcctcgttgga-3。T-DNA的插入位点和引物位置见图1a，T-DNA的侧翼序列见图1b。在非转基因水稻中，P3+P2扩增出一条787 bp的PCR产物;在转基因纯合体中，P1+P2扩增出一条298 bp的PCR产物，由于T-DNA序列过长，P3+P2没有扩增产物。在转基因杂合体中同时扩增出787 bp和298 bp的2条PCR产物。

1.2.3  三引物多重PCR检测体系  PCR反应体系为15 μL，包含10×PCR 缓冲液（含Mg2+）1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL和适当量的三引物P1、P2、P3。P1、P2和P3浓度为10 μmol/L，P1、P2、P3引物使用量分别为0.15、0.30、0.15 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性40 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环;72 ℃延伸5 min。

2  结果与分析

2.1  二引物及三引物PCR体系对水稻材料扩增的特异性

以转基因材料TT51-1、非转基因水稻R650及TT51-1×R650的F1 DNA为模板，利用二引物P1+P2、P3+P2及三引物P1+P2+P3体系进行PCR扩增，结果见图2。用P1+P2二引物体系时，在转基因材料TT51-1、TT51-1×R650的F1 DNA中扩增出一条约298 bp的片段，在非转基因材料R650中没有扩增产物（图2a）;用P3+P2二引物体系时，在转基因材料TT51-1中没有扩增产物，在非转基因材料R650、TT51-1×R650的F1 DNA中扩增出一条约787 bp的片段（图2b）;用P1+P2+P3体系进行PCR时，在转基因材料TT51-1中扩增出一条约298 bp的片段，非转基因材料R650中扩增出一条约787 bp的片段，在TT51-1×R650的F1 DNA中能同时扩增出298 bp和787 bp两条片段。

2.2  三引物多重PCR扩增体系在转基因后代材料中的验证

利用二引物P1+P2、P3+P2及三重引物P1+P2+P3 PCR扩增体系对TT51-1与非转基因水稻R650回交后代BC3F2 8个不同单株进行检测，结果见图3a、图3b、图3c。利用二引物PCR检测时，在TT51-1中仅能扩增出一条298 bp的阳性片段，在R650仅能扩增出787 bp阴性片段;二引物PCR对回交后代BC3F2不同单株进行检测，所有株系只能显示一条带（图3a、图3b），仅能检测转基因后代外源基因的有无，不能区分转基因是杂合还是纯合;而利用三引物检测，同二引物检测结果一样，在TT51-1中仅能扩增出一条298 bp的片段，在R650仅能扩增出787 bp阴性片段;转基因纯合单株能扩增出一条阳性片段，转基因阴性株系只能扩增出一条阴性片段，而转基因杂合株系能同时扩增出298 bp和787 bp的片段（图3c）。检测结果表明，这些材料中该三因素PCR扩增体系可以准确地区分转基因杂合体、转基因阳性纯合体和转基因阴性纯合材料。

收获8株的BC3F2种子种植为BC3F3代株系，取20株进行三引物PCR检测（图4）。结果表明， 来自BC3F2代转基因纯合和转基因阴性单株的BC3F3家系目标基因稳定，为转基因纯合和转基因阴性基因型（图4a、图4b），而来自BC3F2代转基因杂合单株的BC3F3家系中目标基因发生分离，出现转基因杂合、转基因纯合和转基因阴性单株（图4c）。结果表明，利用该三引物多重PCR扩增体系可以准确地鉴定出TT51-1及其衍生的后代材料中转基因杂合、转基因纯合和转基因阴性植株。

3  讨论

建立了用于检测转基因水稻TT51-1及其回交后代材料中外源基因的三引物多重PCR检测体系，该体系可以准确简便地区分出转基因杂合、转基因纯合和转基因阴性3种基因型，为利用TT51-1进行分子标记辅助育种提供了一种简单有效地鉴别植株基因型的技术方法。

多重PCR技术利用一次PCR反应检测多个靶标DNA片段，相比传统PCR省时省力。该技术已广泛地应用于转基因植物的检测，主要是用于同时检测多个外源基因成分的存在[8-10]，也有利用外源基因插入的側翼序列设计共显性引物标记进行多重PCR检测转基因的基因型[5-7]。但不同的外源基因，不同的转化事件，其涉及的DNA序列不同，引物也就不同，PCR反应条件也不相同。

本研究根据TT51-1中特异转化事件，设计了3个特异引物，通过对转基因供体、转基因受体及回交后代不同单株的扩增验证，证明该体系可简单有效地应用于TT51-1及其衍生材料中外源基因型的检测。

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