杨成莲，段鳕芸，钟桂书

肿瘤细胞是一群异常增殖的细胞，与正常细胞的能量供应方式不同，其糖代谢的特征性改变是有氧糖酵解，即Warburg 效应[1]。随着研究的深入，发现肿瘤细胞间存在代谢共生[2]。肿瘤细胞生长迅速、血管生成不足使得肿瘤内存在乏氧区与富氧区。乏氧区肿瘤细胞以糖酵解方式供能为主，将丙酮酸生成乳酸。而富氧区主要采用氧化磷酸化方式产能，通过乳酸穿梭机制利用乏氧区产生的乳酸，将乳酸转化为丙酮酸再进入三羧酸循环产生三磷酸腺苷（ATP）。乳酸脱氢酶（LDH）由A、B 亚基(LDH-A、LDH-B)构成的四聚体酶，它是糖酵解过程中丙酮酸与乳酸相互转化的关键酶，也是丙酮酸生成之后惟一的酶。丙酮酸是进入糖酵解途径还是三羧酸循环，与LDH的活性有关[3]，因此LDH 成为肿瘤代谢研究的关键点。当组织发生恶变时，LDH 与肿瘤的增生、侵袭呈明显相关性，目前已在乳腺癌等多种肿瘤中检测到LDH 的活性明显升高，且在不同的肿瘤中LDH-A和LDH-B 的表达存在差异[4]。本研究旨在通过检测LDH-A、LDH-B 在皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC）组织中的表达水平，探讨LDH-A、LDH-B 在CSCC 进展中发挥的作用，为其进一步研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 收集西南医科大学附属医院皮肤科2013 年01 月—2017 年12 月确诊的CSCC 88 例，男42 例,女46 例，年龄42～93 岁，平均年龄（62.55±14.11）岁,病程1 个月～30 年，平均病程（31.74±4.10）个月，均无淋巴结转移。按世界卫生组织（WHO）分类标准将CSCC 划分为Ⅰ～Ⅳ级，Ⅰ～Ⅱ级为高分化CSCC（40 例），Ⅲ～Ⅳ级为低分化CSCC（48 例）。肿瘤部位：头面部70 例，四肢8 例，颈部6 例，胸腹部4 例。所有石蜡标本均经组织病理检查明确诊断，所有患者为首次就诊，术前未接受过放化疗、光动力治疗及其他特殊治疗，且未并发内脏肿瘤。取该院外科手术切除的正常皮肤组织40 例作为对照组，男20 例，女20 例，年龄22～72 岁，平均年龄（64.18±13.02）岁，其中头面部32 例，四肢4 例，颈部2 例，胸腹部2 例。

1.1.2 试剂 鼠抗人LDH-A 多克隆抗体、鼠抗人LDH-B 多克隆抗体（美国Santa Cruz 公司），MaxVisionTMHRP 免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒（福州迈新生物技术开发公司）。LDH-A 抗体工作液浓度为1:100，LDH-B 抗体工作液浓度为1:200。

1.2 方法

石蜡标本3 µl 连续切片，经脱蜡、水化、柠檬酸盐高压煮沸法修复抗原、3%H2O2阻断内源性过氧化物、抗体孵育。采用免疫组化Maxvision 法，具体操作参照试剂盒说明书。DAB 显色、苏木精复染。免疫组化染色阳性对照为已确定为阳性表达的乳腺癌组织切片，PBS 代替一抗为阴性对照。

1.3 结果判定标准

LDH-A、LDH-B 均以胞质或胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。由2 位以上的有经验的病理科医师对切片进行随机观察。每个标本选取免疫染色丰富区域，在400 放大倍数下随机选取5 个视野，按一定顺序计数200个肿瘤细胞，并对其进行着色强度和比例评分：基本无着色记0 分，浅棕黄色记1 分，棕黄色记2 分，棕褐色记3 分。着色细胞占计数细胞百分率＜10%记1 分，10%～50% 记2 分，50%～80%记3 分，＞80%记4 分。以上两项评分相加：0～2 分或着色细胞数＜10%为（-），3 分 为（+），4～5 分 为（++），6～7 分为（+++）。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0 统计软件进行统计学分析，采用χ2检验分析CSCC 组与对照组之间阳性表达率，采用等级资料的秩和检验分析肿瘤分级与阳性表达程度的差异，采用Spearman 相关性检验分析两样本相关性。以α=0.05 为检验标准，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LDH-A、LDH-B 在CSCC、正常皮肤组织中的表达

LDH-A、LDH-B 蛋白阳性产物主要定位于胞质，呈棕黄色颗粒。正常皮肤组织的基底层和附属器细胞质仅少量表达LDH-A 和LDH-B，呈浅棕黄色颗粒。CSCC 细胞质可见LDH-A、LDH-B 呈现不同程度表达（图1，图2），且明显高于正常皮肤组织，差异有统计学意义（χ2LDH-A=35.939，χ2LDH-B=31.709，P＜0.05）。LDH-A、LDH-B 在CSCC 中的表达在患者性别、年龄、病程、肿瘤大小、部位、数目上的差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 LDH-A、LDH-B在CSCC组织和正常皮肤组织中的表达 [例(%)]

图1 LDH-A在正常皮肤组织和CSCC中的表达（MaxVision法×200）

图2 LDH-B在正常皮肤组织和CSCC中的表达（MaxVision法×200）

2.2 高分化与低分化CSCC 组织中LDH-A、LDH-B蛋白的表达情况

LDH-A 在低分化CSCC 组织中的阳性表达更高，差异有统计学意义（χ2=11.641，P＜0.05）。而LDH-B 在高分化CSCC 组织中的阳性表达更高，差异有统计学意义（χ2=15.387，P＜0.05），见表2，表3。

表2 高分化与低分化CSCC组织中LDH-A的表达 [例(%)]

表3 高分化与低分化CSCC组织中LDH-B的表达 [例(%)]

2.3 LDH-A 和LDH-B 蛋白表达的相关性分析

经Spearman 等级相关分析表明，CSCC 组织中LDH-A 和LDH-B 蛋白表达并无相关性（r=0.079，P＞0.05），见表4。

表4 CSCC组织中LDH-A和LDH-B表达的相关性 [例(%)]

3 讨论

肿瘤细胞的代谢特征之一就是有氧糖酵解，一分子葡萄糖虽然只能产生两分子ATP，但效率极高。高度恶性的肿瘤细胞其糖代谢率可达正常细胞200倍以上，因此肿瘤组织内能产生与正常组织相当的ATP 的量[5]。目前有氧糖酵解的机制尚未阐明，可能与Ras 和c-Myc 等癌基因激活或抑癌基因失活等多靶点调控有关，通过直接上调并激活糖酵解相关酶和抑制三羧酸循环通路中的酶，包括上调编码LDH 的基因表达和蛋白修饰[6]。另一方面，乳酸作为糖酵解的产物在维持肿瘤能量供应，诱导肿瘤干细胞生成、血管形成，促进肿瘤增生和侵袭也起重要作用。同时研究发现肿瘤细胞间以及肿瘤细胞与周围间质细胞间均存在乳酸穿梭机制[7,8]。乳酸可能是比葡萄糖更重要的能量运载体[9]，因此LDH 受到进一步关注。

LDH-A、LDH-B 由不同基因编码，分别定位于11 号和12 号染色体。A 亚基主要催化丙酮酸生成乳酸，B 亚基则促进乳酸向丙酮酸转化。两种亚基按不同比例组成LDH1～LDH5 5 种同工酶。研究表明，LDH-A 在恶性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、大肠癌等多种恶性肿瘤中表达上调,并与肿瘤大小、恶性程度呈正相关[10]。抑制LDH-A 基因表达，能抑制乳腺癌的糖酵解，明显降低肿瘤生长和转移能力，可能与肿瘤PI3K-AKT-mTOR 信号通路激活有关，激活的mTOR 促进低氧诱导因子（HIF-1a）表达，HIF-1a 表达增强能上调LDH-A 表达，下调LDH-B表达，进而促进糖酵解进行[11]。目前有关LDH-B 的研究发现，在肺癌、髓母细胞瘤中已检测到高表达的LDH-B,但在呈现高度恶性的前列腺癌及肝癌细胞中却少量表达，可能与LDH-B 基因启动子的甲基化有关[12,13]。

本实验结果显示，LDH-A、LDH-B 在CSCC中的表达明显高于正常皮肤组织，可能与肿瘤高度活跃的糖代谢有关。此外，低分化的CSCC 组织中LDH-A 的表达明显高于高分化组织，提示升高的LDH-A 水平与CSCC 的恶性程度有关。相比之下，低分化的CSCC 恶性程度更高，增生速度更快，易造成血管生成不足。出现局部氧供、葡萄糖供应不足。肿瘤细胞为适应组织内的低氧微环境，LDH-A 基因转录能被HIF-1a 增强，倾向于糖酵解方式供能，加速葡萄糖转变为乳酸[14]。相反，高分化的CSCC 组织中能检测到更高的LDH-B 表达，可能由于LDH-B能催化乳酸的再利用及促进有氧氧化的进行。有趣的是CSCC 组织中LDH-A 和LDH-B 表达并无相关性。考虑与肿瘤组织中代谢是动态变化的过程，受到血供、氧供等肿瘤微环境影响，而A、B 亚基的基因转录、翻译和修饰过程受到多基因及信号通路调控等有关。有研究表明，CSCC 肿瘤面积＞2 cm2者转移率、复发率增高[15]，但本实验结果中并未发现LDH-A 表达水平与肿瘤大小相关，这可能与CSCC 相较于恶性黑素瘤等肿瘤恶性程度低。本研究所选标本尚无淋巴结及全身转移，随后可以扩大样本量及对转移灶进行深入研究。

Liu 等[16]对前列腺癌患者长达15 年的随访发现，癌组织中高LDH-A 水平和低LDH-B 水平的患者临床预后更差。因此，LDH-A 和LDH-B 的表达对评价CSCC 的发展有重要的临床价值，二者在CSCC 中的作用及调控的机制还需进一步阐明。