张忠华，刘素平，谭紫仙，杨 琨

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 榆中 730124）

牦牛是青藏高原地区标志性的土著动物之一，是已经在形态和生理上适应了青藏高原高寒、低氧环境的牛种，也是青藏高原地区各种生活资源的主要来源之一。

低氧诱导因子家族（HIFs）是一类重要的适应性低氧反应的调控因子[1]。低氧诱导因子2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）是低氧诱导因子家族的异构体之一，是肺血管对急性和慢性低氧做出反应的重要调节因子，具有调控血管再生的功能，包括细胞增殖、血细胞成熟、血管生成、肺血管发育和胚胎发育等[2，3]。在高寒和低氧条件下，适量的增加低氧诱导因子2α在牦牛肺脏器官的含量能够提高细胞对低氧的适应力，使ATP产能增加、减少氧化物产量[4]。

该研究以1岁牦牛的肺脏为试验材料，通过免疫组织化学染色和HE染色的方法检测HIF-2α蛋白在牦牛肺脏中的表达分布并为牦牛的低氧研究提供形态学资料，为HIF-2α在高原动物适应高寒低氧环境生化机制的研究奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为1岁健康牦牛的肺脏组织，在牦牛被放血后立即收集,并用4%多聚甲醛溶液立即固定采集的组织。材料于2018年5月份在西宁屠宰场获取。

1.2 材料处理

取大约1 cm3的肺脏组织制成石蜡切片（厚4～5 μm），用于HE染色和免疫组织化学染色试验。

1.3 试验试剂

主要的试验试剂包括HIF-2α兔多克隆抗体（bs-1447R）、SP试剂盒(兔)（SP-0023）和DAB染色试剂盒（C02-04001，均购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.4 免疫组化检测

采用HIF-2α兔多克隆抗体作为HIF-2α抗体，按1∶100的比例稀释，加入一抗(HIF-2α兔多克隆抗体)的组织在37℃环境下孵育2～3 h。试验操作步骤根据SP试剂盒和DAB染色试剂盒的说明书进行。阴性对照试验不加HIF-2α兔多克隆抗体。

1.5 结果判定

免疫组织化学染色的结果分为强阳性表达、中性阳性表达、弱阳性表达和阴性表达。显色结果为深棕黄色是强阳性表达、棕黄色比背景色深是弱阳性表达、位于强阳性和弱阳性之间为中性阳性表达、阴性表达为棕黄色。

2 结果

2.1 牦牛肺脏的组织学结构

牦牛肺脏HE染色及HIF-2α蛋白免疫组化染色如图1所示。通过对HE染色的肺脏组织切片进行组织学观察，1岁健康牦牛肺脏的肺泡壁较薄，由Ⅰ型上皮细胞衬覆。牦牛肺脏具有丰富的肺泡，近似为多面形或半球形的囊泡结构，并且开口于肺泡囊和呼吸性细支气管等，肺泡间有大量的毛细血管网，如图A所示。

图1 牦牛肺脏HE染色及HIF-2α蛋白免疫组化染色

2.2 免疫组织化学检测VEGF蛋白表达

在1岁牦牛肺脏组织中，免疫组化染色结果显示HIF-2α蛋白在血管外膜、肺泡导管、终末支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中为强阳性表达，在肺泡I型细胞、肺泡II型细胞、呼吸性细支气管上皮细胞、肺血管和肌细胞中为阳性表达（详见图B）；阴性对照无阳性反应（详见图C）。

3 讨论

牦牛是高原地区的典型动物，在高寒低氧环境下生活的牦牛已在形态和生理上适应了高原的严酷条件[4]，牦牛的肺脏在结构方面与生活在低海拔地区动物的肺脏相比具有差异，牦牛肺脏的肺血-空气屏障比低海拔的动物都要薄，这有利于增加气体交换过程中的氧扩散；当生活在低海拔的黄牛暴露在高海拔环境下时，很容易发生严重肺动脉高压和右心衰竭[5]；与奶牛和黄牛的血管外径与肺微动脉中膜的平滑肌厚度的百分比相比，牦牛的百分比更小，这说明高原地区的牦牛肺动脉高压，牦牛更适合在高海拔的环境下生活[6]。

氧气是调节HIF-2α表达的关键因素[1]，且HIF-2α是细胞对低氧适应和肺血管对急性和慢性低氧做出反应的重要调节因子[2]。在正常的氧浓度水平时HIF-2α的表达量较低，仅具有维持血管密度平衡的作用，然而在缺氧时HIF-2α的表达量显著升高，有学者发现HIF-2α的缺失能够导致致命的呼吸窘迫综合征（RDS），这是由于肺泡II型细胞表面活性剂生产不足所导致的[7]。试验结果发现HIF-2α在1岁牦牛肺脏中血管外膜、肺泡导管、终末支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的表达量很高，表明低氧能够提高HIF-2α在1岁牦牛肺脏中的表达水平，进而影响牦牛的肺功能，这可能是牦牛能在高寒低氧的环境下生存的重要影响因素。

4 结论

本试验通过研究HIF-2α在1岁牦牛肺脏中的表达分布情况，发现该蛋白于牦牛肺脏中血管外膜、肺泡导管、终末支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞高表达，结合HIF-2α对肺脏血管有促进功能，得出低氧能促进HIF-2α在牦牛肺脏中的表达，进而推测HIF-2α因子对牦牛适应高原低氧环境有着重要作用。