高新谱，张玮晔，史源，范鹏飞，王清平，沈中阳（1.天津医科大学,天津 300070；.天津市第一中心医院，天津 30019；3.中国人体器官捐献管理中心，北京 100010）

近年来，公民逝世后器官捐献（donated after circulatory death，DCD）成为解决国内器官短缺的主要途径，由于部分类型的边缘供肾热缺血时间较长，导致热缺血损伤较重［1-3］，肾移植术后植入功能不良（poor graft function，PGF）、延迟性移植物恢复功能（delayed graft function，DGF）等并发症发生率不断增加，也对传统经典UW液静息低温保存技术（static cold storage，SCS）提出了新的挑战，SCS保存技术已无法满足日益增长的临床需求，因此，需要研发新型器官保存技术以满足临床实际需求［4-6］。本研究通过稳定的猪自体肾移植模型，研究常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）保存技术对猪DCD供肾活力评估、提高供肾保存质量的意义及其相关机制。

1 资料和方法

1.1 选用由蓟县实验动物基地提供得成年雄性小型猪10只，体重30～35 kg，术前禁食24 h，禁水8 h。所有动物处置遵照天津市《实验动物管理条例》。按照保存方式不同随机分为2组，实验组（NMP保存组，n=5）：热缺血30 min后获取供肾，NMP保存7 h后，行自体肾移植术；对照组（SCS保存组，n=5）：热缺血30 min后获取供肾，4℃低温环境下，UW静息保存7 h后行自体肾移植术。

1.2 供体手术：麻醉诱导采用3%戊巴比妥钠1 ml/kg，气管插管，呼吸机维持呼吸。正中切口逐层入腹，游离双肾动脉、肾静脉，输尿管置管引流。肝素化（500 U/kg）10 min后获取供体血液200 ml，存储于血袋备NMP保存使用。热缺血30 min后获取双侧肾脏，使用4℃UW液（2000 U/L肝素）1000 ml灌注，然后根据不同保存方法进行保存。

1.3 保存方法及装置：对照组采用500 ml UW液4℃低温保存。实验组NMP循环保存液包括200 ml全血，300 ml生理盐水，300 ml低分子右旋糖苷-40，水溶性维生素10 ml，5%碳酸氢钠20 ml，地塞米松10 ml，还原性谷胱甘肽600 mg，复合氨基酸30 ml，注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠1.5 g，12 500 U肝素，10 ml葡萄糖酸钙。根据血气分析结果添加碳酸氢钠。维持灌注压力40～70 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），氧流量0.5 L/min，37℃环境。

1.4 自体肾移植：在肾脏保存结束后重新麻醉及气管插管，Satinsky钳阻断下腔静脉及腹主动脉，采用端-侧缝合分别将肾静脉连续缝合在下腔静脉，将肾动脉与腹主动脉连续缝合，静脉推注500 mg甲强龙后，并使用胶体液快速输注，维持血压在100 mmHg以上，其后开放血流，供、受体输尿管使用6～0 Proline线侧-侧连续缝合重建，逐层关腹，拔除颈动脉插管，留置中心静脉导管，便于术后输液采血。待肌力恢复、自主呼吸后拔除气管插管，放回饲养笼并持续补液。术后3 d，每天给予头孢塞夫（3 mg/kg）、甲硝唑500 mg预防感染。术后每天观察尿量并补液。

1.5 术后标本采集及观察指标：在各时间点比较两组动物术后移植肾血清肌酐水平、炎症因子表达、凋亡、肾皮质微循环、术后7 d生存率等指标。

1.6 统计学方法：实验结果采用SPSS 18.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）形式表示，使用t检验或方差分析比较各组样本均数，计数资料采用卡方检验。生存分析采用K-M生存曲线。P＜0.05认为差异有统计学意义，P＜0.01认为有显著性差异。

2 结 果

2.1 手术基本情况（表1）：动物体重、供肾重量、供肾热缺血时间、供肾保存时间、手术时间、血管重建时间等指标，两组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

两组供肾经历30 min热缺血颜色深暗，表面呈灌注不均花斑状表现（图1A），NMP灌注保存1 h后肾脏颜色红润且均匀一致（图1B），对照组供肾始终为花斑状。移植肾血流开放后，实验组移植肾脏，迅速恢复颜色红润且均匀一致，很快有尿液产生（图1C），对照组移植肾脏恢复较慢，颜色偏暗呈灌注不均状（图1D），少尿或无尿。

表1 两组小型猪自体肾移植的基本情况

图1 供肾热缺血30分钟（A）；NMP保存中（B）；实验组血流开放后（C）；对照组血流开放后（D）

2.2 灌注期间相关指标变化：实验组灌注期间双肾灌注压力稳定（图2），灌注流量稳定（图3），双肾尿量逐渐增加（图4）。

图2 灌注保存期间左肾（A）及右肾（B）动脉灌注压力变化

图3 灌注保存期间左肾（A）及右肾（B）动脉灌注流量变化

图4 灌注保存期间左肾（A）及右肾（B）尿量变化

2.3 自体肾移植术后血清肌酐检测（表2）：自体肾移植术后1 d，对照组血清肌酐水平较实验组明显升高，术后3、7 d，实验组血清肌酐水平逐渐降低，接近正常，对照组恢复缓慢，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 自体肾移植术后血清肌酐水平变化

2.4 肾组织常规病理检查：热缺血30 min后，肾小管局灶性凝固性坏死，肾小管呈中度水样变性、空泡变性。实验组保存1 h后空泡变性、水样变性明显减轻，保存2、3、4、5、6、7 h各时间点供肾损伤无明显加重，空泡变性较轻，肾小管无明显损伤。对照组1 h后空泡变性、水样变性明显，损伤较重。3、4、5、6、7 h各时间点供肾损伤逐渐加重，出现弥漫性滴状变性及空泡变性，并出现肾小管扩张损害。

术后24 h实验组及对照组移植肾病理（图5）。实验组移植肾皮质炎症反应较轻，髓质透明管型较少，肾小球形态相对正常，对照组炎症反应重，髓质管型较多，肾小球形态异常。

图5 自体肾移植后24 h，移植肾穿刺活检病理（HE染色，放大20倍），炎症反应（如*所示）及透明管型（如箭头所示）

2.5 肾组织免疫组化

2.5.1 肾动脉开放后24 h肾组织ET-1表达（图6）：肾组织ET-1免疫组化，实验组开放后24 h ET-1阳性表达明显低于对照组，半定量评分分别为（2.42±0.57）比（6.65±1.87）（P＜0.05），两组间相比差异具有统计学意义。

2.5.2 肾动脉开放后24 h肾组织caspase-3表达（图7）：自体肾移植术后24 h移植肾caspase-3阳性表达明显低于对照组，半定量评分分别为（9.06±2.31）比（16.90±4.25）（P ＜ 0.05），两组间相比具有统计学差异。

图7 术后24 h肾组织caspase-3表达半定量评分

2.6 肾组织TUNEL法凋亡检测：开放后肾组织TUNEL法凋亡定量法检测，实验组开放后24 h凋亡细胞阳性率，较对照组明显降低，分别为（9.62±2.59）% 比（32.20±5.93）%（P＜ 0.05），两组间相比差异有统计学意义。

2.7 肾皮质微循环血流监测（图8）：移植后24 h实验组单位面积内肾皮质血流明显高于对照组，分别为（2 983.83±360.83）比（780.53±143.38） BPU（P＜0.05），两组间相比亦有统计学差异。

2.8 术后1周生存率比较：5只对照组动物术后1周存活率分别为100%（5/5）。5只实验组动物存活亦超过7 d，术后1周存活率为100%（5/5），与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

图8 肾动脉开放后24 h肾皮质微循环监测

3 讨 论

3.1 NMP对DCD供肾的保护作用：在缺血缺氧的低温环境下，代谢底物缺乏。氧供缺乏导致细胞ATP供应由无氧酵解产生，生成丙酮酸、乳酸导致细胞质及线粒体基质pH值降低，ATP耗竭导致钠-钾ATP泵功能异常，破坏细胞膜及线粒体功能，导致线粒体膜通透性转换及细胞色素C释放入细胞质激活凋亡途径［7］，并导致开放后中性粒细胞及血小板聚集于窦状隙，最后导致开放后肝窦微循环血流明显降低，甚至局部完全无血流［8］。NMP是在生理环境下保存供体器官，彻底改变了传统低温保存的理论［9］，NMP对DCD供肾具有一定修复作用［10-11］。

本研究结果证实相对与UW液SCS低温保存，NMP对DCD供肾的保存具一定优势，证据如下：自体肾移植术后1 d，对照组血清肌酐水平较实验组明显升高，实验组术后3、7 d，实验组血清肌酐水平逐渐下降，接近正常，对照组恢复缓慢。热缺血30 min后，肾小管局灶性凝固性坏死，肾小管呈中度水样变性、空泡变性。NMP组保存后空泡变性、水样变性明显减轻，UW液组各时间点供肾损伤逐渐加重，出现弥漫性滴状变性及空泡变性，并出现肾小管扩张损害。虽然两组生存率无统计学差异，但是样本量偏少，需要进一步实验证实对移植物生存率及受体生存率影响。

3.2 NMP对DCD供肾的保护作用具体机制：本研究证实，NMP保存通过降低肾组织ET-1表达改善供肾微循环，减轻微循环紊乱，实验组开放后24 h ET-1阳性表达明显低于对照组。移植术后24 h实验组单位面积内肾皮质血流明显高于对照组。肾微循环障碍与ET-1水平升高有密切关系，ET-1可以强烈持久的收缩肾小球出、入球动脉，造成时肾皮质微血管强烈收缩，微循环障碍，从而影响肾实质的血液灌注，加上低温、缺血、缺氧共同加重肾脏损伤［12-15］。

本研究中，NMP保存DCD供肾始终处于生理环境，而且始终保持血管切应力，不仅避免了冷缺血对微循环的影响，通过降低肾组织ET-1表达及改善微循环，改善供肾血供，进而改善术后移植肾脏功能。

本研究还证实NMP通过降低caspase-3水平减少肾实质细胞凋亡，实验组开放后24 h caspase-3阳性表达明显低于对照组。开放后肾组织TUNEL法凋亡定量法检测结果，自体肾移植术后24 h凋亡细胞阳性率，实验组较对照组明显降低。本实验中NMP保存组移植后24 h，实验组不仅肾组织caspase-3阳性表达明显低于对照组，而且肾实质细胞凋亡率明显下降，因此可证实NMP通过降低caspase-3水平减少肾实质细胞凋亡。

3.3 总结及本研究局限性：本研究成功建立双肾NMP保存装置，可明显减轻DCD供肾保存损伤及缺血/再灌注损伤，其保护机制涉及降低肾组织ET-1表达及改善供肾微循环，降低caspase-3水平及凋亡减轻缺血/再灌注损伤。本研究局限性：① 样本量较少；② 自体模型缺少免疫因素；③ 观察时间较短；④ 损伤机制不全面，例如细胞因子释放、炎症细胞浸润、ATP耗竭等；⑤ 7 h保存时间尚需延长；⑥ 需要和HMP保存技术对比；⑦ 装置需要进一步优化与工业设计。在未来研究中将克服这些局限及缺陷。