陈 津，王方军

（1.福建厘科大学临床分子诊治研发中心，福建医科大学附属第二医院 泉州 362000；2.中国科学院分离分析化学重点实验室，中国科学院大连化学物理研究所 大连 116023）

正常细胞中蛋白质激酶受到严格调控，蛋白质激酶表达量和活性发生变化将引起细胞生物学过程的紊乱甚至导致癌症等恶性疾病的发生。早在20世纪70年代末期，科研人员就发现了激酶和癌症的联系，激酶活性不受控制将会引起细胞性状发生改变最终导致疾病[1-3]。利用靶向小分子抑制剂或激动剂对特定蛋白质激酶的活性进行特异性调控能为相关疾病提供有效的治疗方案，小分子抑制剂也成为了目前最重要的抗肿瘤药物之一。截止2017年，共有38种小分子激酶抑制剂类药物获美国FDA批准并应用于临床。目前已经有5000多种蛋白质激酶和蛋白质激酶-抑制剂复合体的晶体结构被成功解析，极大促进了人们对抑制剂作用机理的理解并为新型小分子抑制剂药物的设计合成提供了重要参考。靶向激酶的小分子抑制剂是生命健康领域的一个重要研究热点，探究蛋白质激酶与小分子相互作用机制可以为各种疾病治疗药物的设计研究提供重要指导[4]，包括肿瘤[5]，神经学[6]，免疫学[7]，心脏病[8]和传染病[9]等。

1 蛋白质激酶和小分子抑制剂简介

蛋白质激酶是一类能将底物蛋白质磷酸化的磷酸基转移酶，将ATP上的γ磷酸基团转移到底物蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上[10]。蛋白质磷酸化在细胞信号的传导中起着至关重要的作用，直接影响着蛋白质的功能、相互作用和信号通路，对细胞的生长、增殖、代谢、转录、分化、衰亡等过程产生重要影响。人类基因编码中有518种蛋白质激酶[11]，可分为传统型和非典型蛋白质激酶。传统型激酶（478种）可划分为AGC、CAMK、CK1、CMGC、STE、TK和TKL等激酶家族。剩余的40种激酶可归属于13个非典型激酶家族[12]。不同家族的激酶针对不同类型的蛋白质底物，在信号通路中的功能也有显著差异。根据磷酸化作用的蛋白质不同，还可将蛋白质激酶分为丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶STK（serine/threonine-specific protein kinase）和酪氨酸蛋白质激酶TPK（tyrosine-specific protein kinase）。在人源蛋白质激酶中有约80%属于STK激酶[11]。

表1 靶向蛋白质激酶的小分子抑制剂的分类

蛋白质激酶结构有较大相似度，尤其是其催化活性结构域高度保守。在此区域中含有主要由β-折叠（β-sheet）构成的N-lobe区域和主要由α-螺旋（α-helix）构成的C-lobe区域。ATP结合在两者构成的沟状区，并且和N-lope和C-lope之间有相互作用。除此之外，ATP还和蛋白质激酶其他结构保守的区域有相互作用，比如连接N-lope和C-lope的铰链区（hinge region），磷酸基团结合环（phosphate-binding loop，P-loop），活化环（activation loop），催化环（catalytic loop）等[13,14]。通常，hinge region能与ATP中的腺苷有氢键等相互作用；P-loop中含有保守序列GXGXФG（Ф为苯丙氨酸或者酪氨酸），能灵活靠近ATP并与磷酸基团发生作用[15]。活化环末端还存在一个保守的DFG（Asp-Phe-Gly）序列区域。

小分子激酶抑制剂是一类可以靶向结合并调控蛋白质激酶活性的小分子化合物，根据他们相互作用机制的不同，可以将小分子抑制剂分成六种类型（表1）[16]。Type I抑制剂结合“DFG-in”构象状态下的蛋白质激酶（即天冬氨酸和苯丙氨酸指向ATP结合位点）；Type II抑制剂结合“DFG-out”构象下未被激活的蛋白质激酶。以上这两种类型抑制剂都是通过竞争占据ATP的结合位置达到抑制酶活性的目的，属于ATP竞争型抑制剂。Type III抑制剂的作用位点十分接近ATP结合区域；而Type IV抑制剂的作用位点偏离ATP和底物的结合区域。这2种抑制剂都是天然的别构型抑制剂，通过结合激酶蛋白质非ATP结合区域调节蛋白质结构从而实现激酶活性调控。因为所有蛋白质激酶均具有序列结构高度保守的ATP结合区，ATP竞争型抑制剂往往特异性较差。为了选择性结合并调控某一特定的蛋白质激酶，发展别构型抑制剂是提高调控选择性的关键。Type V抑制剂（也称作bivalent inhibitors）通常连接着激酶结构域中两个不同的区域，以Src激酶为例，它的type V抑制剂一端是ATP类似物另一端是非底物配体双磷酸化肽段，分别结合激酶的ATP结合区域和SH2结合域从而抑制激酶活性[17]。以上这五类抑制剂主要通过氢键、盐桥键、疏水相互作用等非共价作用力靶向蛋白质激酶，属于可逆型小分子抑制剂。Type VI抑制剂与上述种类抑制剂不同，是通过共价键与激酶相连的不可逆抑制剂。

目前通过FDA批准的激酶小分子抑制剂药物中，涉及到多种类型，例如靶向CDK4/6的抑制剂Palbociclib属于Type I；靶向B-Raf的抑制剂Dabrafenib属于Type II；靶向MEK1/2的抑制剂Trametinib属于Type III；靶向FKBP12/mTOR的抑制剂Temsirolimus属于Type IV；靶向BTK的抑制剂Ibrutinib属于Type VI等。然而，这些抑制剂的使用经常会伴随一些副作用的产生，包括血球减少、皮肤病、消化系统异常、抑郁症、肺病等[18]。因此，研究激酶与小分子抑制剂的相互作用机制，开发新型高效无副作用的抑制剂仍然面临着巨大挑战。

2 基于质谱的蛋白质激酶和小分子抑制剂相互作用研究

X射线晶体衍射（X-ray diffraction,XRD）[19,20]、冷冻电镜（Cryo-electron microscopy,Cryo-EM）[21,22]和核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）[23-25]等分析方法已经被广泛用于蛋白质激酶和小分子相互作用机制研究，但这些常规分析方法对蛋白质样品的用量和纯度要求较高、样品制备困难、分析通量较低。近年来，一系列基于质谱技术的蛋白质-小分子相互作用分析方法得到快速发展（表2），这些方法具有灵敏度高、通量高、样品制备简单、可确定相互作用位点等特点，已经成为传统分析方法的重要补充。本综述主要针对基于质谱的蛋白质激酶-小分子相互作用普适性分析方法的主要研究进展。

2.1 氢氘交换-质谱分析方法

氢氘交换质谱分析（hydrogen-deuterium exchangemass spectrometry,HDX-MS）是指利用氘代溶剂（D2O，CH3OD等）与样品蛋白质分子上的氢原子发生互换，并通过质谱检测酶解肽段质量偏移确定发生氢氘原子交换的蛋白质序列位置[26]。一般容易发生氢氘交换的氢原子多位于蛋白质与溶液的接触界面，比位于蛋白质结构内部或参与氢键形成的氢原子的交换速率更快，可以根据氢氘交换速率的不同探测蛋白质的结构及动态变化[27]。当小分子抑制剂与激酶结合时，会影响结合位置的氢原子的氢氘交换速率，通过氢氘交换速率的变化可以探究小分子和激酶的相互作用区域及强度。HDX-MS具体操作流程主要分成以下几个步骤[28]：分别让蛋白质和蛋白质-抑制剂复合物与氘代试剂混合实现氘代标记；在一定交换时间后通过酸化水溶液（pH2.5）实现蛋白质变性并尽量维持在0℃左右终止氢氘交换反应；进行蛋白质酶解并对酶解肽段混合物进行色谱串联质谱连用（LC-MS/MS）系统进行分析。根据实验获得肽段质量偏移随着时间的变化曲线可以解析抑制剂存在的情况下蛋白质的动态变化。除了蛋白质或者蛋白质-小分子复合物本身结构的性质之外，影响氢氘交换速率的还有溶液的pH、温度等因素[29]。

HDX-MS作为蛋白质结构和相互作用动力学研究的一个有效工具，已经被成功用于蛋白质激酶与小分子（如ATP及其类似物、核酸小分子、药物小分子等）相互作用机制分析[30,31]。Marshall等人将该技术用于研究药物imatinib、sunitinib与产生抗药性的激酶receptor tyrosine kinase（KIT）的相互作用机理，发现蛋白质激酶突变体D816H使KIT变成活性形式从而无法与抑制剂结合；而突变体V560D有两种低能量结构，一种结构松散类似于D816H，一种结构相对紧凑，类似于野生型KIT，受到这两种低能量结构的影响，抑制剂对突变体V560D的抑制效果介于野生型和突变体D816H之间[32]。Zhang等人将HDX-MS用于别构抑制剂GNF-2与酪氨酸激酶Bcr-Abl的结合位置和相互作用机理研究[33]。氢氘交换质谱分析主要缺点是在样品酶解、色谱分离、质谱离子化等过程中存在明显的氢氘原子回交现象，这将显著影响分析的准确性，限制了该方法的应用。并且，此方法对样品预处理和色谱分离等条件控制较为严格，例如必须低温操作降低回交现象，从而极大影响了蛋白质样品的酶解效率、肽段色谱分离分辨率等[26]。

2.2 共价化学标记-质谱分析方法

交联质谱分析（cross-linking combined with MS，XL-MS）是近年来迅速发展的研究蛋白质结构和相互作用的质谱分析技术。交联反应包括将一个蛋白之内或者两个蛋白之间功能基团通过化学交联试剂共价连接，蛋白质酶解后对发生交联反应的肽段进行富集和分离鉴定从而确定空间上相邻的两个交联位点[34]。通常来说，交联试剂由一个特定长度的间隔臂连接着两个功能基团，这两个基团根据性质可与蛋白质的赖氨酸、半胱氨酸或其他氨基酸发生共价化学反应[35]。蛋白质交联后可直接进入质谱分析，比如Nazabal和Wenzel考察了抑制剂PKF17、PKF118等对蛋白复合物tymidin kinase/TCf4/β-catenin的影响[36]。此外，还可以通过对交联的蛋白质进行酶解，对酶解后的交联肽段进行分析。酶解后的肽段混合物在进入液相色谱串联质谱分析之前，往往还会采用富集或分离手段（如体积排阻色谱[37]，离子交换色谱[38]，亲和标签富集[39,40]等）对交联肽段进行富集从而降低样品的复杂程度。交联质谱分析方法已被成功用于研究蛋白磷酸酶PP2A复合物结构[41]和进行内源性蛋白质复合物的深度覆盖分析[42]。

基于活性的蛋白质组分析[43]（activated-based probe profiling，ABPP）是应用化学探针（activated-based probe，ABP）靶向蛋白质中有特定结构和生物活性的区域。该化学探针由反应基团、报告基团和将二者相连的聚乙二醇链或者碳链组成，反应基团一般是亲电小分子，用于选择性结合蛋白酶的活性中心，报告基团可以是荧光基团、生物素基团或者是用于引入新基团的正交反应基团等[43,44]。Cravatt实验室将小分子碎片结合亲电基团作为亲电试剂，靶向结合蛋白质中的活性半胱氨酸位点。为了得到该小分子与蛋白质的相互作用信息，还需引入化学探针（该化学探针可通过“点击”反应引入轻重标签）[45]。具体过程如下：将样品分成等量的两份，一份加入亲电试剂随后加入化学探针与之反应，另一份直接加入化学探针处理。而后分别引入轻重标签后混合，富集，酶解，液相色谱串联质谱分析。此时，先与亲电试剂结合和直接与化学探针结合的活性半胱氨酸位点所在的肽段的质谱强度存在显著差异，根据所在肽段定量的比值来判断小分子与蛋白质的相互作用，从而为抑制剂的设计等提供指导[45]。例如，该方法证明了亲电试剂靶向MAP3激酶MLTK的第22位的活性半胱氨酸的位点会抑制该激酶的活性并且还能够得到产生相互作用的小分子等[45]。

以上共价化学标记方法中所采用的化学反应试剂存在分子尺寸较大，难以标记位阻较大的蛋白质微观结构区域；并且所采用的标记反应如针对赖氨酸侧链氨基的酰胺化等反应会严重影响相应蛋白质的电荷分布、结构和活性[46,47]，标记后的蛋白质基本上都失去生理活性。

针对上述共价化学标记的方法的不足，Zhou等人发展了基于赖氨酸侧链二甲基化的活性标记方法用于研究蛋白质复合物中的赖氨酸近程微环境（Lysine Proximal Microenvironment，图1）。由于标记试剂分子量小，能对蛋白质复合物中的全部赖氨酸进行结构特异性差异标记；由于该反应不影响蛋白质电荷情况，在标记后蛋白质仍然能够保持生物学活性；从而实现了大分子量蛋白质复合物（700 kDa）内部蛋白质相互作用的系统分析[48]。Linden等人根据1252个激酶-配体的晶体结构得到85个与配体结合位点相关的激酶保守序列的氨基酸[12]，发现甘氨酸、赖氨酸等氨基酸在保守区域的多个位点均有分布，对赖氨酸近程微环境的分析有利于蛋白质激酶尤其是保守区域与小分子的相互作用的研究。并且，在生理条件下蛋白质中的赖氨酸一般带正电荷，与邻近氨基酸残基间的相互作用如静电相互作用、氢键等是调节蛋白质结构和蛋白-蛋白相互作用的关键因素之一。小分子抑制剂常与激酶的赖氨酸残基相互作用从而更好地靶向蛋白质激酶并抑制其活性，例如抑制剂MK2206、PIA23分别与AKT1激酶的K268[49]、K14[50]位点；抑制剂Imatinib与ABL1激酶的K271位点[51]；抑制剂MP7与PDK1激酶的K111位点[52]等都存在相互作用。分析赖氨酸近程微环境相互作用对于研究蛋白质及蛋白质复合物的结构和功能调控机理具有重要作用，在研究蛋白质激酶和小分子相互作用上表现出极大的潜力。

2.3 基于蛋白质热稳定性的质谱分析方法

蛋白质的结构随着温度的升高发生改变，由此可以得到关于蛋白质的热熔解曲线（thermal melting curve），当小分子结合蛋白质时会引起蛋白质稳定性的变化从而影响其热熔解曲线[53,54]，具体表现在热熔解曲线发生偏移（cellular thermal shift assay，CETSA）[55]。

图1 基于二甲基化标记的活性标记方法研究赖氨酸的近程微环境

蛋白质随着温度的升高会发生变性随后发生聚沉[56]，这将导致在磷酸盐缓冲液中的溶解该蛋白质的量逐渐减少[55-57]。Mikhail等人依据这点特性，通过定量标记试剂TMT标记溶解的蛋白质组样品，结合液相色谱串联质谱，实现一次进样同时分析蛋白质的十个温度点的热稳定性，得到蛋白质的热熔解曲线。通过对比蛋白质和蛋白质-小分子的热熔解曲线的偏移，高通量的筛选小分子或药物在活细胞中的作用底物蛋白质[58]。例如，为蛋白质激酶抑制剂十字孢碱（staurosporine）确定了50多个靶点蛋白质（如激酶PKN1，AURKA）。此外，Huber等人也利用蛋白质的热稳定性的变化得到甲氨喋呤等小分子的靶向底物[59]。基于热稳定性的方法能够得到小分子与蛋白质在细胞内的相互作用信息，这更能反应蛋白质实际的生理环境。总而言之，这种检测热稳定性变化的方法能有效鉴定药物的靶向蛋白质底物，有助于系统研究药物功效和毒性。然而，该方法不能给出药物与靶向蛋白的具体位点结合信息。

2.4 活性质谱（Native MS）分析

随着高分辨、高质量检测范围质谱技术的快速发展，质谱已经能对保持活性结构和活性的大分子量蛋白质直接进行分析检测，分析对象通常是纯化蛋白质样品[60]。Jecklin等人将丝裂原活化蛋白质激酶MAPK14和酪氨酸激酶LCK（lymphocyte specific kinase）与17种激酶抑制剂结合，并通过质谱信号分析得到抑制剂-激酶的解离常数等[61]。Heck等人结合高分辨率、高精度Exactive Plus Orbitrap分析了分子量150 kDa的蛋白质激酶PKG（cGMP-dependent protein kinase）与小分子cAMP和cGMP相互作用[62]。具体过程为（图2），PKG与小分子cAMP或cGMP共同孵育，在ATP和镁离子的参与下PKG发生磷酸化（图2A），通过EDTA中止磷酸化修饰，并在低温（4℃）下置换成可与质谱兼容的醋酸铵溶液（图2B），随后将含有活性蛋白激酶-小分子复合物的溶液直接进入高分辨率质谱进行分析，并对得到的高精度谱图进行数据分析（图2C，D）。根据分析的结果，cAMP和cGMP可分别使PKG发生高达13和6个的磷酸化修饰[62]。然而，该方法无法直接确定发生修饰的具体位点，需要通过对蛋白质进行酶解再根据酶解的肽段的液相色谱串联质谱分析（即“自下而上”的蛋白质组学分析）方法来确定具体修饰位点[62]。

图2 Native MS分析蛋白质激酶和小分子相互作用

表2 基于质谱的蛋白质激酶-小分子相互作用的方法

2.5 限制性蛋白质酶解

蛋白质酶解切过程中需要底物蛋白质匹配蛋白酶活性位点的诱导机制形成水解反应过渡态。当活性蛋白质区域结构不能被蛋白酶识别，例如与小分子相互作用或发生蛋白质折叠，则该蛋白质区域不能被蛋白酶完全水解，即发生限制性蛋白质水解（limited proteolysis，LiP）[63]。通过研究活性蛋白质与小分子结合前后的酶切区域和效率差异即可得到部分小分子与蛋白质的相互作用区域和强度信息。Picotti等人利用限制性蛋白质酶解结合酶解产物质谱分析对蛋白质不同生理状态结构变化及其与小分子相互作用进行了高通量分析[64,65]。当小分子结合活性蛋白质时阻碍了蛋白酶（proteinase K）水解小分子相互作用区域，从而显著降低该蛋白质区域的酶解效率。限制性酶解完成后将蛋白质变性并用蛋白酶充分酶解,通过质谱定量分析构象不同区域对应的肽段，从而推断出蛋白质与小分子的相互作用区域。通过此方法，Picotti等人发现了未被报道的PfkB激酶的抑制剂磷酸烯醇丙酮酸盐、柠檬酸盐和鸟苷三磷酸[65]。限制性蛋白水解的方法可以用来测试药物与蛋白质的相互作用情况并确定药物的作用区域，但是对酶解条件的控制要求较为严格。

3 总结和展望

蛋白质激酶在生命过程中发挥着重要作用，许多恶性疾病如肿瘤的产生与蛋白质激酶密切相关，人们对设计研发靶向蛋白质激酶的新型小分子抑制剂的要求十分迫切。基于质谱的分析方法能够全面、系统、准确地研究蛋白质激酶-小分子相互作用，并给出作用位点（或区域）和作用强度等信息，从而更好的为药物的设计和疾病的治疗提供帮助。随着技术的发展，基于质谱的分析手段将不断的发展和完善，必定会极大地推动蛋白质激酶-小分子相互作用分析研究，从而更好的为人类的健康服务。