李 志， 冷 羽， 曹 波， 邓文玲， 董聿锟

（贵阳中医学院第一附属医院， 贵州 贵阳550001）

肛门直肠瘘简称肛瘘， 是指直肠或肛管与周围皮肤相通的一类常见疾病， 病因大多为肛周脓肿或直肠肛门损伤。 目前其主要治疗方式为手术， 术后创面为防止继发感染需予以暴露直至愈合， 但自然情况下术后创面愈合缓慢， 病程长， 严重影响患者生活质量， 故如何促进术后创面愈合成为临床工作中面临的关键问题。 本研究对湿润生肌膏促进肛瘘创面愈合的疗效及相关机制进行探索， 以期为该制剂的临床应用提供依据， 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 对象、 分组、 一般资料、 临床诊断标准 研究对象为2014 年6 月至2016 年12 月于贵阳中医学院第一附属医院肛肠科收治的90 例单纯性肛瘘术后患者， 随机数字表法分为3 组， 其中术后使用湿润生肌膏治疗的30 例患者作为观察组， 使用龙珠软膏治疗的30 例患者作为对照组， 使用凡士林纱条治疗的30 例患者作为凡士林组， 3 组性别、年龄、 体质量、 创面平均纵经差异均无统计学意义（P＞0.05）， 具有可比性， 见表1。 临床诊断标准参照美国结直肠外科医师协会于2011 年推出的美国肛周脓肿和肛瘘治疗指南［1］， 即内口在肛隐窝，仅有1 个瘘道通过外括约肌皮下部或浅部， 与皮肤相通； 所有创面纵径在2.5～3.0 cm 之间、 术后伤口深度达外括约肌浅部的低位单纯性肛瘘。 患者及家属均自愿同意参与本研究， 并签署知情同意书。

表1 3 组患者一般资料比较（±s， n＝30）Tab.1 Comparison of general data among the three groups （±s， n＝30）

表1 3 组患者一般资料比较（±s， n＝30）Tab.1 Comparison of general data among the three groups （±s， n＝30）

组别 性别比［（男／女）／例］ 年龄／岁 体质量／kg 创面平均纵经／cm观察组 6.5（26／4）38.01±5.17 58.9±12.8 2.81±0.19对照组 9（27／3）37.68±4.38 57.6±15.8 2.78±0.27凡士林组 6.5（26／4）37.85±5.05 58.4±14.3 2.74±0.25

1.2 材料 Leica RM2235 切片机（德国Leica 公司）； Olympus DSX100 光学显微镜（日本Olympus公司）； NanoDrop 2000 超微量分光光度计（美国NanoDrop 公司）； Applied Biosystems 9700 实时荧光定量PCR 仪 （美国Applied Biosystems 公司）；Eppendorf 5424R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。 RNA 提取试剂Trizol、 逆转录试剂盒、SYBR Green 核酸荧光染料（日本TaKaRa 公司）；苏木素-伊红试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）； 龙珠软膏（马应龙药业集团股份有限公司）。甲醛、 甲醇、 异丙醇、 无水乙醇等（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 湿润生肌膏制备 组方黄芩、 黄柏、 甘草、白芨、 紫草、 冰片（湖北西银和生物科技有限公司， 25 kg／桶， 批号20140409）、 硼砂（湖北西银和生物科技有限公司， 25 kg／袋， 批号20140328）、川芎、 壁虎粉。 将黄芩、 黄柏、 甘草、 白芨、 川芎、 壁虎粉洗净后， 105 ℃下干燥4 h， 与紫草一起粉碎， 过120 目筛， 加入冰片和硼砂， 研匀， 加入乳膏基质（硬脂酸、 单硬脂酸甘油酯、 液状石蜡、 白凡士林、 羊毛脂作为油相， 三乙醇胺、 蒸馏水作为水相， 分别于水浴上加热至80 ℃左右。 等温下将水相缓慢倒入油相中， 水浴上不断搅拌至呈乳白色半固体状， 再在室温下搅拌至近冷凝）， 研匀， 即得。

2.2 创面处理及术后给药 术前均备皮、 清洁灌肠， 连续硬膜外麻醉。 患者均行瘘切除术， 修剪创缘， 使切口呈下窄上宽的“V” 字型， 以便引流通畅， 切口均不缝合， 创面纵径2.5 ～3.0 cm。 换药前均常规消毒， 每天1 次至创面愈合（术后均使用同种抗生素5 d、 止血药3 d、 止痛药3 d）。

2.3 标本收集 术后第7 天换药时， 组织剪剪下2.0 mm×2.0 mm 新鲜肉芽组织， 取30 mg 左右置于冻存管中液氮保存， 剩余组织放入事先准备好的10%福尔马林溶液试剂瓶中， 作好编号， 送至病理实验室。

2.4 肉芽组织VEGF、 bFGF mRNA 表达检测 采用RT-PCR 法。 液氮中取出30 mg 肉芽组织， 无菌条件下剪碎并研磨， 加入1 mL RNAiso Reagent 试剂， 冰上裂解5 min 后吸取上清液， 加入1.5 mL离心管中， 严格按照说明书进行提取， 将所得RNA 沉淀于室温下干燥10 min， 50 μL 无核酶水稀释沉淀并混匀， 37 ℃下促溶5 min， 超微量分光光度计检测RNA 浓度。 取1 μg进行逆转录， 严格按照试剂盒说明书进行操作， 得到20 μL PCR cDNA产物后， 无核酶水稀释至500 μL， RT-qPCR 体系配置10 μL SYBR Green 核酸荧光染料， 加入5 μL（10 ng） 模板cDNA 及5 μL 引物， 每个样品设置3个平行孔， 置于PCR 仪中进行定量分析。 循环参数为预变性94 ℃4 min； 扩增条件为94 ℃30 s，60 ℃1 min， 共40 个循环； 血管内皮生长因子（VEGF） 正向引物GGGCGCGCCGCGGAGGGGGTGCTGG， 反向引物AGACCCTGGTTGCCAGGTCATGCGG， 扩增引物249 bp； 碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 正 向 引 物 GGAGCCCAGGGAATGCCAAAGCCCT， 反 向 引 物GCAGGTGGAAAGATCTGATCTTGGA， 扩增引物211 bp。 以β-actin 为内参基因， 其正向引物序列 TGGCACCCAGCAC AATGAA， 反向引物序列CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA， 目的片段186 bp； 以VEGF、 bFGF表达量与内参基因表达量的比值作为其mRNA 相对表达量。

2.5 肉芽组织毛细血管数检测［2］采用苏木素-伊红染色。 取出10%福尔马林溶液固定好的肉芽组织， 二级水冲洗后自然晾干， 进行石蜡包埋， 于50%、 70%、 80%、 90%、 95% 乙醇及无水乙醇中各处理40 min， 无水乙醇与二甲苯混合液（比例1 ∶1） 处理1 h， 二甲苯处理30 min， 二甲苯与软蜡（比例1 ∶1） 处理1 h， 软蜡、 硬蜡分别处理1 h， 切片机制成4 μm 切片， 之后严格按苏木素-伊红试剂盒说明书进行染色。 苏木素染色切片在光学显微镜下观察， 每张切片取5 个视野， 计算每个视野内具有完整管腔的毛细血管数（×200）。

2.6 创面愈合时间测定 即创面完全上皮化所需时间， 上皮化依靠肉眼观察［3］。 每天换药观察创面愈合程度， 如创面被新生肉芽组织填满， 覆盖组织完全上皮化， 即确定为创面愈合时间。

2.7 统计学分析 通过SPSS 17.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示， 方差分析比较计量资料间的统计学差异， SNK 法进行多组资料间的两两比较， χ2检验比较计数资料间的统计学差异， 检验水准α ＝0.05。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 VEGF、 bFGF mRNA 表达 观察组术后第7天VEGF mRNA 相对表达量为0.763±0.082， 显著高于对照组的0.401±0.043、 凡士林组的0.315±0.032 （P＜0.05）。 观察组术后第7 天bFGF mRNA相对表达量为1.370±0.127， 显著高于对照组的1.049±0.062、 凡士林组的0.597±0.084 （P ＜0.05）。 见图1。

图1 3 组VEGF、 bFGF mRNA 表达比较Fig.1 Comparison of VEGF and bFGF mRNA expressions among the three groups

3.2 毛细血管数 观察组术后第7 天创面肉芽组织镜下， 每个视野的毛细血管数为（30.06±5.25）个， 显著多于对照组的（24.80±4.58） 个、 凡士林组的（15.30±3.07） 个（P＜0.05）。 见图2。

3.3 创面愈合时间 观察组创面愈合时间为（17.03±3.35） d， 显著短于对照组的 （18.87±2.72） d、 凡 士林 组 的 （22.13 ± 3.63） d （P ＜0.05）。

4 讨论

肛瘘是一种临床常见病， 主要表现为肛周流脓， 伴疼痛、 瘙痒或排便不畅， 大多数患者不能自愈， 需要手术治疗， 但由于手术创口所在肛周活动性大、 极易污染， 术后创面不可缝合， 自然愈合过程相当缓慢， 导致患者病程较长， 严重影响生活质量。 中医认为， 肛瘘术后创面湿热未尽， 毒热内聚， 并由于经络损伤、 气血不畅， 致创面失于荣养， 愈合迟缓； 现代医学指出， 重组人表皮生长因子可有效促进创面愈合［4-5］， 但目前大多应用于烧伤， 对肛瘘术后创面的愈合疗效尚不确切。

图2 3 组毛细血管数比较（×200）Fig.2 Comparison of blood capillary counts among the three groups （×200）

目前， 多种中成药能通过促进创面组织上皮细胞表皮生长因子的释放、 上皮细胞的增殖、 外基质的合成， 进而加速创面愈合［6-8］。 课题组前期研究［6］发现， 湿润生肌膏较龙珠软膏、 凡士林纱条能更有效缓解患者疼痛， 并可加速患者术后创面愈合， 但相关机制及途径尚不完全清楚。 创面修复涉及多种细胞因子参与、 成纤维细胞增殖、 新生血管形成等多个环节［9］， 其中VEGF 是由2 个分子量17～22 kD 亚基形成的二聚体， 在代谢旺盛、 供血丰富的组织中有着高表达， 是内皮细胞特异的有丝分裂原［10-11］， 具有强大的促血管生成作用， 并对血管内皮细胞有特殊的专一性［12］， 其表达增加可有效促进毛细血管内皮细胞增殖、 新生血管生成［13］、 血管内皮细胞迁移和管腔形成， 整合血管内皮细胞功能结构协调同步发展［14］； bFGF 与VEGF 一样， 作为内皮细胞特异的有丝分裂原也具有广泛的促细胞增殖效应［15-16］， 可促进细胞分化，通过调控内皮细胞迁移、 纤溶酶原产生来调控机体内血管新生的整个过程［17-18］。 研究结果显示， 观察组术后用药第7 天创面肉芽组织中VEGF、 bFGF mRNA 表达均显著高于对照组和凡士林组， 表明湿润生肌膏能有效上调两者表达， 也在分子层面上体现了该制剂优势， 其机制可能与所含黄芩、 黄柏等药材对血管内皮细胞的保护作用有关［19-21］。 然后，观察了各组术后第7 天创面肉芽组织中毛细血管数， 发现观察组显著多于其他2 组， 进一步说明VEGF、 bFGF 存在协同作用， 可共同促进创面肉芽组织新生毛细血管形成， 而湿润生肌膏可促进两者表达上调， 相比龙珠软膏有着更显著的疗效。 同时， 观察组创面愈合时间显著短于其他2 组， 也印证了湿润生肌膏对肛瘘创面愈合的确切疗效。

综上所述， 湿润生肌膏可通过上调VEGF、bFGF mRNA 表达， 促进肛瘘术后患者肉芽组织中毛细血管生成， 进而加快创面愈合， 提高生活质量， 有利于预后， 是值得临床推广的治疗方式。