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(西安文理学院 化学工程学院 西安市环境与食品安全检测工程研究中心，陕西 西安 710065)

西安文理学院应用化学专业的质量检测方向，旨在培养可以从事食品、药物、材料等方面进行分析检测的综合应用型人才。要求学生掌握基本的分析检测方法，具备合格检测人员应有的基本素养，并具有较强的分析问题和解决问题的能力。目前，本专业的实验内容多为验证性实验，且实验方法及检测技术较为陈旧，难以调动学生学习的积极性，达不到全面培养学生综合实验素质的目标，因此对现有检测方法进行更新，结合科研实验成果，设计了以1,8-萘酰亚胺探针对乳品真蛋白乳品中酪蛋白进行定量分析的综合实验。

由于中国国家标准中乳品蛋白质检测方法的缺陷，出现掺加尿素、铵肥、三聚氰胺等氮含量高的有机物来提高“蛋白质含量”的违法操作，严重制约了我国乳制品的质量提升，影响了消费者的身体健康，也为不法分子掺加劣质蛋白以提高蛋白质含量提供可乘之机[1-2]。因此，食品分析必须从真蛋白质测试入手，测定真蛋白质含量，才能够有效避免假冒劣质蛋白质的滥竽充数。荧光探针法是蛋白质检测及分析中常用的方法之一，具有快速、高效、仪器简单、操作简便等特点。但荧光探针在使用中普遍存在的一个问题是，当荧光官能团聚集时会发生荧光减弱或猝灭的现象[3]。近期本课题组的研究表明，1,8-萘酰亚胺荧光探针对酪蛋白的同步荧光呈现强烈的AIE特性，具有显著的选择性识别作用，经前期研究表明，探针的羧基官能团可能渗入酪蛋白内部，以疏水作用及氢键作用结合酪蛋白疏水腔中的色氨酸及酪氨酸残基，而萘酰亚胺发光团及4-号位取代基团被阻挡在外部，聚集在胶团表面，呈现聚集诱导发光增强特性，导致酪蛋白同步荧光增强效应[4-5]。

综上所述，本综合实验设计要求学生制备1,8-萘酰亚胺荧光探针，并研究其对酪蛋白胶团聚集诱导发光效应的作用机制，以建立具有普遍适用性、高效快速的酪蛋白荧光探针检测分析法。实验范围较广，设计方案新颖，与实际应用紧密相连，能够极大调动学生学习实验的积极性，教学效果良好。

1 实验

1.1 实验药品与仪器

药品：正丁醇(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；乙二醇丁醚(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；十六烷基三甲基溴化铵(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；4-溴-1,8-萘酐(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；十八胺(分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司)。

仪器：恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司)；荧光分光光度计(日本岛津制作所)；傅立叶变换红外光谱仪(德国布鲁克公司)。

1.2 实验目的

(1)掌握1,8-萘酐亚胺探针的制备方法。

(2)了解红外光谱(FTIR)、紫外吸收(UV-Vis)以及荧光光谱确定有机化合物结构的方法。

(3)掌握1,8-萘酐亚胺探针对酪蛋白聚集诱导发光特性的研究方法。

1.3 实验步骤

(1)4-溴-N-十八烷基-1,8-萘酰亚胺。称取2.0781g(0.0075 mol)4-溴-1,8-萘酐(A)和1.5291 g(0.0083 mol)十八胺(B)溶于100 mL无水乙醇中，磁力搅拌加热至60 ℃回流，再降温至50 ℃反应4 h，待反应液冷却后抽滤，将滤饼真空干燥得到白色固体粉末2.6410 g，即得到中间产物4-溴-N-十八烷基-1,8-萘酰亚胺(G)。产率79.4%，熔点：165.3～166.3℃。

(2)1,8-萘酐亚胺探针的制备。称取中间产物(G)1.056g(0.0020 mol)加入到50 mL烧瓶中，分别加入氢氧化钠固体颗粒0.5 g，十六烷基三甲基溴化铵0.5 g，正丁醇25 mL，蒸馏水10 mL，磁力搅拌加热至80 ℃，反应6 h，得到黄色浑浊液，待反应液冷却后，抽滤、水洗、干燥得到亮黄色固体。将亮黄色固体溶解于适量的无水乙醇中，冷却至2～5 ℃，静置24 h后，加入适量的蒸馏水，待固体完全析出，抽滤，真空干燥，得到黄绿色固体粉末4-丁氧基-N-十八烷基-1,8-萘酰亚胺，硅胶柱层析，二氯甲烷为淋洗液。

(3)1,8-萘酐亚胺探针结构的测定。1,8-萘酐亚胺的FTIR分析在德国布鲁克公司的衍射仪傅立叶变换红外光谱仪上进行；1,8-萘酐亚胺的UV-Vis分析在北京普析通用仪器有限公司的紫外分光光度仪上进行；1,8-萘酐亚胺的荧光特性在日本岛津制作所的荧光分光光度仪分析。

(4)1,8-萘酐亚胺探针对酪蛋白诱导发光性能的测定。通过探针Scatchard方程计算探针与酪蛋白的结合参数，从而研究其对酪蛋白诱导发光性能的影响。

2 实验结果及分析

2.1 1,8-萘酐亚胺探针制备过程中需注意的问题

制备1,8-萘酐亚胺探针时，如何确定中间产物以及目标产物提纯时重结晶等操作的溶剂的用量、温度、时间等因素的影响。重结晶的结果直接影响到目标产物的性质，对产品的应用起到相当关键的作用，重结晶时需要考虑的因素较多，因此需要确定最优的重结晶的提纯条件。要求学生提前查阅文献资料，通过调变反应温度及物料配比提高1,8-萘酐亚胺探针的产率较高，并确定1,8-萘酐亚胺探针的优化制备工艺。

2.2 1,8-萘酐亚胺探针的结构测定

1,8-萘酰亚胺分子结构上的萘环具有较大的共轭π键和平面结构，通过1,8-萘酐与十八胺的亚胺化反应，可以得到含有萘酰亚胺结构的荧光化合物。因此，在测定1,8-萘酰亚胺探针结构的时候，应当选用红外光谱(FTIR)、紫外吸收(UV-Vis)以及荧光光谱共同对其结构进行确定。在此基础上，要求学生掌握各种测试方法及结构分析的方法。

图1 1,8-萘酰亚胺探针FTIR图谱

图2 1,8-萘酰亚胺探针UV-Vis 图谱

1,8-萘酰亚胺探针UV-Vis 谱图如图2所示。学生由UV-Vis 图谱可以看出化合物在波长为430.5 nm附近具有最大吸收峰，表明该种化合物的分子结构中存在较大的共轭关系和电子离域性。1,8-萘酰亚胺探针的紫外全波长扫描呈现较好的吸收，吸收曲线平滑，可能是该种化合物样品的纯度较高，且在乙醇溶液中的稳定性较好。

1,8-萘酰亚胺探针荧光光谱如图3所示。学生由图3-B中可以看出，1,8-萘酰亚胺探针的激发波长在λex=450 nm，通过确定激发波长，可以得到该化合物的发射波长范围，且最大发射波长为545 nm，荧光相对强度较大，可能是引入的十八烷基和正丁基增大了萘酰亚胺分子结构的共轭性和平面结构。

图3 1,8-萘酰亚胺探针的激发光谱(A,λex=450nm)和发射光谱(B,λem=545nm)

2.3 1,8-萘酐亚胺探针对酪蛋白聚集诱导发光效应的影响

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白质，大约占到总蛋白含量的80%，主要以胶团状态存在于乳中，它是以含磷蛋白质为主体的几种蛋白质的复合体，其中，酪蛋白含有大量疏水性的酪氨酸残基。色氨酸和酪氨酸残基位于位于酪蛋白疏水腔第一和第二子域之间，对于酪蛋白胶团的自组装具有重要作用，同时也是酪蛋白在350 nm附近内源性荧光的主要体现基团设想探针的双羧基作为前导嵌入式基团插入酪蛋白疏水腔中，与色氨酸和酪氨酸残基以非共价键作用，如疏水、氢键作用等相结合，导致未结合的氨基酸残基包埋在疏水腔中，使得酪蛋白胶团结构更加紧实；而1,8-萘酰亚胺荧光基元则吸附于胶团表面导致探针分子的聚集，引起聚集诱导发光效应。

探针与酪蛋白的结合参数由Scatchard方程计算：

log[(F0-F)/F]=logK+nlog[P]

(1)

K为结合常数，F0、F分别为探针加入前后酪蛋白的荧光强度，P为探针浓度，利用log[(F0-F)/F]对log[P]作图可求得K和n，根据van't Hoff方程：

(2)

T分别为298、302、306和310K，以lnK对1/T作图求得ΔH，ΔS，自由能变(ΔG)由下式计算：

ΔG=ΔH-TΔS

(3)

表1 探针与酪蛋白结合参数

探针与酪蛋白结合参数列于表1中；由表1可知，ΔH 为负值、ΔS 为正值，根据Ross判断生物大分子与小分子作用力性质的规律表明，疏水作用及氢键作用为探针-酪蛋白复合物的主要结合作用力，其中疏水作用由于色氨酸残基本身疏水性所致，而探针的双羧基则是氢键作用的主要因素。

设想机理如图4。

图4 酪蛋白与探针聚集诱导发光机理图

2.4 实验拓展

学生可以进一步确定经济合理、安全有效、产物产率较高的合成条件。已确定反应原料之一的4-溴-1,8-萘酐，另一种原料的确定需要综合考虑各方面的因素，包括颜色、形状、毒性、熔点、挥发性、稳定性等物理化学性质。

3 问题与讨论

在该综合实验中需要学生思考及讨论的问题如下：

(1)制备1,8-萘酐亚胺探针有哪些影响条件？

(2)紫外吸收光谱确定1,8-萘酐亚胺探针结构的原理是什么？

(3)1,8-萘酐亚胺探针对酪蛋白荧光发射性能有怎样的影响？

4 教学特色

该实验是为应用化学专业质检方向大三学生开设的食品检测综合实验，经过前2学年相关课程如有机化学、精细有机合成、精细化学品分析、食品质量检测方法、天然化学产物等课程的学习，学生已经了解有机化合物的制备方法、紫外分光光度法及荧光分光光度法的基本原理。该综合实验要求学生独立制备有机化合物，自主操作检验检测仪器，并对所得数据进行分析，不但可以充分锻炼了学生的实践动手能力，也能够强化学生的分析处理数据的能力。从实际的教学效果来看，该实验极大调动了学生的学习积极性，能够为学生后续的实际工作及进一步的学习深造打下坚实的基础。

5 结束语

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白质，大约占到总蛋白含量的80%，主要以胶束状态存在于乳中。由于国标中乳品蛋白质检测方法的缺陷，出现掺加尿素、铵肥、三聚氰胺等氮含量高的有机物来提高“蛋白质含量”的违法操作，严重制约了我国乳制品的质量提升，影响了消费者的身体健康。因此，该综合实验结合当前大众关注的食品安全检测问题，将实验室的科研成果转化为教学和实验教学内容，制备出新型的1,8-萘酰亚胺探针并实现其对酪蛋白的检测，对质检方向学生实验操作及创新能力提出了新的要求，进一步促进了高效科教融合及教育转型发展。