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(济南出入境检验检疫局，山东 济南 250014)

食品添加剂被誉为现代食品工业的灵魂，可改善食品的色、香、味和口感，增加营养价值，延长保质期，改善食品加工工艺。食品添加剂添加量一般不超过2%，但涉及的食品范围宽，影响作用大。据统计，目前世界上食品添加剂使用的品种在5 000种以上，我国使用的食品添加剂已达22个门类近1500个品种。其中依据GB2760-2014，植物油中允许添加的着色剂方面有3种，分别是沙棘黄、玉米黄、胭脂树橙等，但是其相应的检测方法还不甚成熟，而且胭脂树橙、沙棘黄、玉米黄色素均为混合色素，主色素的确定及含量、辅成分的使用宜忌还没有文献明确说明，这也是本文的工作重点。

玉米黄质(Zeaxanthin,3，3'-二羟基-β-胡萝卜素，简写为YMHZ)，亦称玉米黄素，分子式C40H56O2，相对分子质量为566.88，属于异戊二烯类，是一种含氧的类胡萝卜素[1]，与叶黄素属同分异构体，广泛存在于绿色叶类蔬菜、花卉、水果、枸杞和黄玉米中[2]。

胭脂树橙主要色素成分为红木素(Bixin)和降红木素(Norbixin)[3-4]，橙紫色晶体，熔点217℃(分解)，不易氧化，分子式：红木素C25H30O4、降红木素C25H28O4；相对分子质量：红木素394.51；降红木素380.4。水溶性胭脂树橙为红至褐色液体、块状物、粉末或糊状物，略有异臭，主要色素成分为红木素水解产物降红木素的钠或钾盐，染色性非常好，耐日光性差。

1 材料与方法

1.1 试剂材料与仪器设备

乙腈，色谱纯，默克化工技术有限公司；冰乙酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；水，Milli-Q 超纯水系统制备。Agilent1260 series 液相色谱仪：配有FLD检测器，美国安捷伦公司；分析天平( 感量为0.1 mg ) ：梅特勒-托利多公司；Milli-Q 纯水器：美国Millipore 公司； IKA-KS130型振荡器，德国IK公司；色谱柱：Waters XTerra RP-C18(4.6×250 mm，5μm)。

1.2 液相色谱分离条件

流动相：A,乙腈；B，H2O(含体积分数0.5% 冰乙酸)；梯度洗脱：A-75(5 min)、A-75～95(1 min)、A-95(9 min)；流速：1 mL/ min；柱温：40℃；吸收波长：460 nm；进样体积：10μL。

1.3 标准溶液配制

Bixin标准溶液: 称取Bixin粉剂14.5 mg 置10 mL容量瓶中，加乙腈适量使溶解，未完全溶解部分加入甲醇-冰乙酸(9+1，v/v)约3 mL使之完全溶解，再加乙腈稀释至刻度，摇匀，浓度为14500μg/mL。YMHZ的标准溶液称取YMHZ粉剂12.5 mg 置10 mL容量瓶中，加乙腈适量使溶解，再加入3 mL丙酮使之完全溶解，再加乙腈稀释至刻度，摇匀，浓度为12500μg/mL。

标准曲线: 精确移取不同体积的标准溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。制成质量浓度为0、3、6、15、30、60μg/mL混合标准溶液系列。在设定色谱条件下，分别取10μL进行HPLC分析。以标准系列质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(图1)。

1.4 油脂前处理及测定

精密称取样品约2.000g，加入10 mL正己烷饱和乙腈溶解，40℃超声25 min，离心，取上清液过0.45μm滤膜后上机检测。

2 结果与分析

2.1 色素的标准曲线及线性

图1 两种色素标准样品的液相色谱图

Bixin和YMHZ对照品的色谱图如图1，Bixin线性方程为y=14.07894x+ 0.02007，相关系数r=0.99959；YMHZ线性方程为y=36.98284x-0.88955，相关系数r=0.99947。线性范围均为3～60μg/mL；最低检出限Bixin为1.0 mg/kg，YMHZ为0.10 mg/kg。

2.2 液相色谱条件的选择

用于分析玉米黄素的HPLC系统主要可以分为正相与反相，而反相系统又有反相等度洗脱溶剂系统和反相梯度洗脱溶剂系统两类。采用以硅胶为固定相的正相色谱法很难将玉米黄素与其它类胡萝卜素分离开来，且对于玉米黄素的多种构型更是难以区分，因此正相色谱法目前已被反相色谱所取代。反相溶剂系统的色谱柱常常使用结合有十八炭或三十炭硅烷的氧化硅作为分离柱，因此结合实验室自身的条件，选择了Waters XTerra RP-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱。

在Bixin和YMHZ的分离分析过程中，影响因素很多，除色谱柱之外，流动相及流动梯度是关键。结合化合物结构和性质，初步选择乙腈、甲醇作为流动相中的有机相，水、乙酸水溶液作为流动相中的水相。本文比较了1%乙酸水溶液+甲醇、水溶液+甲醇、0.5%乙酸水溶液+甲醇、2%乙酸水溶液+甲醇、1%乙酸水溶液+乙腈、水+乙腈、0.5%乙酸水溶液+乙腈、2%乙酸水溶液+乙腈这几种流动相，综合对比分析峰型、响应强度、色谱柱等因素，选择0.5%乙酸水溶液+乙腈作为分析检测Bixin、YMHZ的流动相(75+25)，流速为1.0 mL/min。为了调整两种化合物的保留时间，尤其是YMHZ的保留时间，所以在流动相(75+25)的基础上调整了梯度，以减少分析时间；图2为两种化合物的光谱图，不难看出λ=460nm的时吸收强度最强，因此选择460 nm作为检测波长。图3为两种化合物的色谱图，由此可知，各形态完全基线分离，峰型对称、尖锐，满足检测需要。

图2 色素标准样品的液相光谱图

图3 样品及加标回收色谱图

2.3 样品前处理条件的优化

依据文献及化合物本身的结构性质分析，Bixin和YMHZ的提取方式很多，本着简单便捷、减少交叉污染的原则，选择了超声提取方式，提取液则选择了与流动相较为一致的试剂。实验表明，乙腈+乙酸(9+1，v/v)提取油脂中Bixin和YMHZ时，Bixin提取效率最高，但是YMHZ基本无回收；减少了提取溶剂中的乙酸百分比，略有回收，直至全部用乙腈(饱和了正己烷)提取时，两个色素化合物的回收率均高于90%以上。超声萃取具有耗时短、样品无交叉污染的特点，适合大批量样品的测定。经加标回收实验，超声萃取25 min，回收率均在95%以上，满足检测需要。

2.4 酸度对YMHZ的影响

在样品前处理条件优化过程中，偶然发现，酸性环境不利于YMHZ的提取或检测。为了更好的研究酸度对YMHZ的影响，实验室做了一些工作：配置一系列相同浓度的YMHZ标准溶液，含乙酸的体积分数分别为0、1%、2%、5%、10%、15%、20%、30%，液相谱图见图4，其中右图为左图的部分放大。从图片可以看出，YMHZ(纯度为90%)标品中至少包含7种化合物，6号化合物为本文的目标成分，也是含量最高的成分。在乙酸体积分数为0～1%时，谱图中各组分的峰强度并没有明显变化，仅在主峰的右侧出现了一个较小的吸收峰7；随着乙酸体积分数增加，7号化合物的吸收峰逐渐增加，至乙酸体积分数为5%时最强；同时，在乙酸体积分数在0～5%之间时，1、2、3、4、5号吸收峰的强度变化不大。这说明，适量酸度的增强并未对1、2、3、4、5号化合物的结构造成影响，仅仅使得YMHZ的结构发生了变化，改变后的结构极性略微减弱。当乙酸的体积分数大于10%时，各个吸收峰的强度都在减弱；尤其是当乙酸的体积分数大于15%时，1、3、4、5吸收峰消失，2号吸收峰强度基本不变，6和7号化合物减弱到一定程度后也基本保持不变，这说明几种化合物之间的结构转化已经达到了某个平衡后基本不受酸度影响。

图4 YMHZ标准样品受乙酸影响的液相色谱图

对比分析1～7号化合物吸收峰的光谱图时发现，除化合物1外，2～6号化合物均在400～640nm之间有吸收。2号化合物的最大吸收波长约为466 nm与4号化合物的最大吸收波长相近，且在250～640nm之间吸收光谱图形状相近，有可能含有相同或相似的生色基团，不同之处仅在于吸收强度不同而已；而3号化合物与4号化合物的吸收光谱总体相似，但是3号化合物在450 nm有一个相对更强吸收，说明与4号化合物相比，3号化合物至少多包含1个生色基团；5～7号化合物均在400～500 nm间均有吸收，且峰型相似，据报道玉米黄质属于异戊二烯类， 常常与隐黄素、β-胡萝卜素、叶黄素等共存，组成类胡萝卜素混合物，这说明5号化合物可能时玉米黄质的伴生物，都含有类胡萝卜素结构； 6号化合物吸收光谱中b、c、d和7号化合物光谱图中的f、g、h波长基本一致(图5)，区别仅在于e吸收峰与a吸收峰相比有明显的蓝移，而且总体而言，7化合物的吸收峰强度要比6化合物的弱约100倍。这是因为YMHZ是一个大的共轭体，吸收强度较大，但是在酸性条件下，-OH逐渐质子化，分子结构逐步扭曲，共轭结构被破坏，而导致分子吸收强度逐渐减弱，甚至没有吸收。

图5 6和7号化合物的吸收光谱

2.5 Bixin的稳定性

Bixin对照品储存液存储与棕色试剂瓶中，使用溶液需现用现配，最好也是在棕色试剂瓶中，因为，即使在棕色试剂瓶中，Bixin受光照影响也容易发生降解，色谱图见图6，从图上可以看出，Bixin对照品的色谱吸收峰前出现了新吸收峰，保留时间非常接近，这说明与Bixin结构比较相似。对比分析Bixin和Norbixin的分子结构，不难发现，差别仅在于羧基和酯基，因此，在本实验过程中Bixin的降解产物为Norbixin。总之，Bixin在存储使用过程中需谨慎，实验过程中使用的溶液最好是现用现配。光照条件下，Bixin结构中的酯基会发生分解，生成双酸结构，极性略增强，保留时间比Bixin略短。

图6 Bixin对照品在光照30min后的液相色谱图

3 小结

胭脂树橙和玉米黄是GB 2760允许添加的着色剂，限量分别为20、5000 mg/kg。天然的提取的Bixin和YMHZ不但具有良好的生物安全性[2,5]，在抑制肿瘤方面还具有明显作用，是不可多得的天然添加剂，但是从GB2760限量也可以看出，这两种化合物的添加也不是无限制的，首先是因为添加添加剂在提取是很难纯化，其次是因为在使用过程中稳定性相对较差。在本文研究过程中发现：(1)建立食用植物油中Bixin和YMHZ的检测方法，加标回收良好；(2)在酸性条件下，YMHA极不稳定，虽然很多研究表明YMHZ是生物安全系数很高的添加剂，但是其在酸性条件下，结构变化仅限于推测，其生物安全性还有待研究；(3)在研究过程中还发现，即使是Bixin的标准品溶液在20℃光照放置一段时间发生了不同程度的降解，因此在使用过程中需谨慎。