刘燕群， 周中银， 谭诗云

武汉大学人民医院消化内科 消化系疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060

我国是胃癌高发地区，胃癌发病例数和死亡例数分别占全球胃癌发病和死亡的42.6%和45.0%，胃癌引起的死亡率高居各类恶性肿瘤死亡率的第3位[1-2]。早发现、早治疗是提高胃癌患者疗效及改善预后的关键。外科手术治疗仍是胃癌治疗的主要手段。然而，在临床上，由于胃癌患者可能早期无明显症状，即使有了上腹胀或不适等非特异性症状，因未予重视或惧怕胃镜检查等原因，导致很大一部分胃癌患者在临床诊断时已属中晚期，失去了手术价值。肿瘤侵袭转移和复发是导致胃癌患者临床治疗失败和死亡的主要原因。自噬是广泛存在于真核细胞内利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程[3-4]，是细胞应对恶劣环境的生存机制。研究证实，自噬与肿瘤的发生、增殖、侵袭转移等关系密切[5]。

中药重楼又称七叶一枝花，是中医抗肿瘤配方中常用的中药。重楼皂苷Ⅰ是从中药重楼中提取的一种甾体皂苷单体，药理学研究证实其具有广泛药理学活性，包括免疫调节、清热解毒、抗肿瘤、心血管作用等[6-7]。本实验拟观察重楼皂苷Ⅰ对胃癌细胞侵袭能力和自噬的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1主要材料胃癌HGC-27细胞(中科院上海细胞库)；重楼皂苷Ⅰ(中国药品生物制品检定所)；胎牛血清(碧云天生物技术研究所)；Matrigel胶(美国BD公司)；Transwell小室、细胞培养瓶、细胞培养皿、96孔及6孔培养板(Corning公司)；RPMI 1640培养液、辣根酶标记山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(武汉博士德生物科技有限公司)；蛋白浓度测定试剂盒(杭州碧云天生物技术研究所)；EMT标志物抗体(E-cadherin、Vimentin、Fibronectin)、自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白、MMP-9及内参β-actin抗体(Cell Signaling Technology公司)。

1.2方法

1.2.1 细胞培养：HGC-27细胞在37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度条件的恒温箱中，用质量浓度为100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。实验均选用处于对数生长期的细胞进行。

1.2.2 Transwell法检测细胞侵袭能力：实验分为对照组(0 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ)、5 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组、10 μmol/L重楼皂苷Ⅰ组和20 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ组。在4 ℃融化Matrigel胶，于冰上将Matrigel用磷酸盐缓冲液稀释后铺在小室内，室温放置10 min风干后备用；取对数生长期的各组细胞，用不含血清的培养基重悬计数，加入200 μl于Transwell小室上室中(细胞密度为2×105ml-1)，将600 μl质量浓度为100 g/L血清的培养基加入Transwell小室下室，37 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度条件下培养48 h，PBS洗涤3次，用PBS湿润的棉签轻轻拭小室内的细胞，质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定30 min，质量浓度为1 g/L结晶紫染液室温下染色15 min，显微镜下拍照，随机取5个视野计数，统计结果。

1.2.3 蛋白质印迹法检测EMT标志物、自噬相关基因蛋白及MMP-9表达：实验分组及处理同上。消化收集细胞，加入200 μl预冷的含PMSF的蛋白裂解液，用移液器反复抽吸后震荡1 min，4 ℃条件下裂解30 min，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min(离心半径为5.5 cm)，将上清液小心移至经高压消毒的EP管内，根据蛋白测定试剂盒说明书检测蛋白质浓度计算蛋白质含量；采用蛋白质印迹法检测蛋白质表达情况，取40 μg各组样品行SDS-PAGE电泳，再转膜至PVDF膜，质量浓度为50 g/L BSA封闭1 h，根据蛋白分子量切割条带，分别加入一抗，室温下孵育2 h，再次TBST洗膜，ECL显色、曝光、显影、定影、拍照并分析数据。

1.3统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，所有计量数值进行正态性检验，均为正态分布，计量资料以均数±标准差表示，两样本间均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1重楼皂苷Ⅰ对胃癌细胞侵袭能力的影响0、5、10、20 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ处理HGC-27细胞48 h后，Trasnwell结果显示，随着药物浓度的增加，穿过Trasnwell小室基底膜的细胞数逐渐减少，与对照组(0 μmol/L)比较，差异有统计学意义(P<0.05，见图1)。

2.2重楼皂苷Ⅰ对胃癌细胞MMP-9表达的影响0、5、10、20 μmol/L 重楼皂苷Ⅰ处理HGC-27细胞48 h后，蛋白质印迹检测结果显示,随着药物浓度的升高，细胞MMP-9蛋白表达量逐渐降低(见图2)。

2.3重楼皂苷Ⅰ对胃癌细胞EMT标志物表达的影响本实验进一步探讨了不同浓度重楼皂苷Ⅰ(0、5、10、20 μmol/L)对胃癌HGC-27细胞EMT标志物表达的影响，随着药物浓度的升高，上皮标记物E-cadherin蛋白表达量逐渐增加，同时，间叶标记物Vimentin和Fibronectin蛋白表达量逐渐降低(见图3)。

2.4重楼皂苷Ⅰ对胃癌细胞自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达的影响重楼皂苷Ⅰ(0、5、10、20 μmol/L)处理HGC-27细胞48 h后，蛋白质印迹检测结果显示,随着药物浓度的升高，自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达量逐渐增加(见图4)。

3 讨论

近年来在肿瘤治疗等方面取得了许多重大发展和进步，新的抗肿瘤药物或方案层出不穷，但胃癌患者生存率并未明显提高。肿瘤侵袭转移和复发是导致胃癌患者临床治疗失败和死亡的主要原因，因此，新的方法和策略来抑制肿瘤侵袭转移成为肿瘤治疗研究的重点。传统中药的抗肿瘤作用备受关注。本实验中，细胞侵袭实验结果显示，重楼皂苷Ⅰ处理HGC-27细胞48 h后，随着药物浓度的升高，越过Transwell小室基底膜的细胞数逐渐减少。表明重楼皂苷Ⅰ可抑制胃癌HGC-27细胞侵袭能力。

研究证实，EMT是肿瘤原发性浸润和继发性转移的重要机制。EMT是在胞外因素刺激下由上皮细胞表型转化为具有间质细胞表型的过程[6]。在EMT 过程中，细胞极性、细胞间紧密连接和黏附连接逐渐丧失，肌动蛋白细胞骨架发生重组，细胞-细胞间连接蛋白如E-cadherin、γ-catenin等表达减少，而间叶标记物如N-cadherin、Vimentin、Fibronctin等表达明显增加；同时，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteins，MMPs)如MMP-2、MMP-3及MMP-9等活性显著增加，细胞被转化为具有侵袭和运动能力的间叶样细胞表型。本实验中，重楼皂苷Ⅰ处理HGC-27细胞48 h后，蛋白质印迹法检测细胞EMT标志物表达变化情况，结果显示，上皮标志物E-cadherin表达上调，同时间叶标志物Vimentin和Fibronectin表达下调，且MMP-9表达下调，提示重楼皂苷Ⅰ处理后可抑制胃癌HGC-27细胞EMT。

注：与对照组比较，重楼皂苷Ⅰ处理后，穿过人工基底膜的HGC-27细胞数显著减少，#P<0.05。图1 重楼皂苷Ⅰ抑制胃癌HGC-27细胞侵袭能力 A: 0 μmol/L; B: 5 μmol/L; C: 10 μmol/L; D: 20 μmol/L; E: HGC-27细胞数Fig 1 Inhibition of invasion of gastric cancer HGC-27 cells by Polyphyllin Ⅰ A: 0 μmol/L; B: 5 μmol/L; C: 10 μmol/L; D: 20 μmol/L; E: the cell number of HGC-27

图2 重楼皂苷Ⅰ对胃癌HGC-27细胞MMP-9蛋白表达的影响Fig 2 Effect of Polyphyllin Ⅰ on the expression of MMP-9 protein in HGC-27 cells of gastric cancer

自噬是广泛存在于真核细胞内利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程[4,7]，是细胞应对

图3 重楼皂苷Ⅰ对胃癌HGC-27细胞EMT标志物蛋白表达的影响Fig 3 Effect of Polyphyllin Ⅰ on the expression of EMT marker protein in gastric cancer HGC-27 cells

恶劣环境的生存机制。自噬在肿瘤发生、发展的过程中扮演着复杂又重要角色。自噬可通过维护内环境稳定阻止细胞癌变，但当肿瘤形成后，因缺氧等不利因素，自噬可用于维持生存，有助于肿瘤细胞渡过不利的微环境，并能促进恶性肿瘤的增殖和侵袭转移[8]。本实验发现重楼皂苷Ⅰ处理后，HGC-27细胞自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达上调，提示HGC-27细胞自噬水平升高。

图4 重楼皂苷Ⅰ对HGC-27细胞自噬相关基因Atg5、 LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达量的影响Fig 4 Effect of Polyphyllin Ⅰ on the expressions of autophagy related genes Atg5, LC3-Ⅱ and Beclin1 in HGC-27 cells

综上，重楼皂苷Ⅰ处理后，胃癌HGC-27细胞侵袭能力显著降低，肿瘤细胞上皮标记物E-cadherin表达降低，且间叶标记物Vimentin、Fibronctin表达上调；同时，重楼皂苷Ⅰ处理后也可诱导HGC-27细胞发生自噬。提示重楼皂苷Ⅰ对胃癌HGC-27细胞自噬状态及间质化特征有着重要作用，且提示细胞自噬与细胞上皮间质转化之间存在相互影响的关系，下一步我们将进一步探讨重楼皂苷Ⅰ诱导的自噬在胃癌侵袭转移中的作用及机制，并阐明重楼皂苷Ⅰ诱导自噬的机制，为寻找新的抑制胃癌侵袭转移治疗方案及重楼皂苷Ⅰ在胃癌中的临床应用提供理论基础。