陈 浩 ，李新方，孙 渺，张 钢，杨 峰

(1.解放军总医院海南分院药剂科，海南 三亚 572013； 2.海军军医大学药学院，上海 200433；3.陆军军医大学高原军事医学系高原医学教育部重点实验室，重庆 400038)

大蒜是百合科植物大蒜AlliumsativumL.的鳞茎，具有抗菌消炎、降血糖、抗疲劳、防治肿瘤等多种功效[1-3]。近期研究发现，大蒜皂苷具有显著的抗缺氧活性，在缺氧引起的急、慢性高原病及其他相关疾病动物模型中表现出良好疗效，可能成为一种有效的高原抗缺氧药物[4-5]。大蒜皂苷为甾体皂苷，1982年Smoczkiewicz在大蒜提取物中检测到甾体皂苷至今，科学家已经从大蒜提取物中分离鉴定了20种甾体皂苷，其中大蒜皂苷PIEB是大蒜的主要活性成分之一，具有较强的抗缺氧活性[6]。目前未见大蒜皂苷PIEB相关药动学研究的报道，对其含量分析的研究报道也较少。为了获得大蒜皂苷提取物中皂苷成分在生物体内的药动力学参数，本研究以PIEB为标准物质，建立了LC-MS/MS法测定大鼠血浆中大蒜皂苷PIEB的含量方法，并研究了其体内药动学过程，以期为大蒜皂苷提取物，特别是PIEB的合理开发和应用奠定基础[7-8]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(色谱柱：Athena C18-WP，50 mm×2.1 mm,3 μm，美国Waters公司)；TSQ Quantum三重四级杆质谱仪，配ESI源(美国Thermo公司)；台式冷冻离心机(MIKRO200R，Hettich)；超声波清洗机(SK2004，上海科导超声仪器有限公司)；氮吹仪(SBH130D，Stuaet)；IKA振荡器(VXR basic，IKA-Werke)；分析天平(AL104，梅特勒托利多仪器有限公司)。

1.2 试剂

1.3 实验动物

健康清洁级SD大鼠24只，体重200～230 g，雌雄各半，海军军医大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(沪)2015-0028。室温控制在22～28℃，相对湿度为(50±10)%，12 h昼夜节律照明，自由饮水，饲养1周。

2 实验方法

2.1 分析条件

2.1.1色谱条件

Athena C18-WP色谱柱(50 mm×2.1 mm,3 μm)，柱温25℃；流动相A为水-乙腈(99∶1，0.05%甲酸)，B为乙腈-水(99∶1，0.05%甲酸)。梯度洗脱：0～6 min，10%～40%B；6～7 min，40% ～90%B；7～9 min，90%～10%B；流速：0.3 ml/min；进样量：10 μl。

2.1.2质谱条件

采用负离子SRM工作模式；离子源为ESI源；喷雾电压为3 000 V；加热温度为200℃；毛细管温度300℃；鞘气流速12 L/min；辅助气流速3 L/min；PIEB的离子对m/z:1 259.04→1 097.70。

2.2 样品的配制及处理

PIEB标准储备液：精密称取 PIEB 0.01 g置10 ml容量瓶中，用少量50%甲醇水溶液超声溶解，定容至刻度，制成储备液，浓度为1 mg/ml，于冰箱(-20℃)冷冻备用。

我国竞争中立制度的具体实践在上海自贸区条例中有所体现。《中国(上海)自由贸易试验区条例》(以下简称《条例》)中㉔第四十七条明确规定了各类市场主体在自贸试验区内，在监管、税收和政府采购方面享有公平待遇，这实际上就是OECD提出的竞争中立制度所包含监管中立、税收中立、政府采购中立等内容。但这并不意味着我国竞争中立政策仅强调公平竞争，我国竞争中立还包含了自由竞争的目标，自由竞争的目标更多被规定在我国竞争法中。同时，《条例》是在法治环境章节具体规定竞争中立制度的，这不仅强调了竞争中立制度的法律权威性，也表现出竞争中立作为自贸区基本价值尺度的地位。㉕

PIEB标准储备液稀释液：精密吸取100 μl PIEB储备液、900 μl 10%甲醇水溶液，混匀，得100 μg/ml PIEB标准储备液稀释液。

PIEB标准液：精密吸取243 μl PIEB标准储备液稀释液、757 μl 10%甲醇水溶液，置1.5 ml尖底EP管中，涡旋混匀，浓度为24.3 μg/ml；精密吸取100 μl PIEB标准液、200 μl 10%甲醇水溶液，置1.5 ml尖底EP管中，涡旋混匀，依法逐级稀释，得浓度为8 100、2 700、900、300、100 ng/ml系列标准液。

PIEB血浆标准样品的配制：精密吸取10 μl PIEB标准液、90 μl空白血浆，混匀，得浓度为10、30、90、270、810、2 430 ng/ml系列血浆标准样品。

大蒜皂苷总提取物溶液的配制：精密称取大蒜皂苷总提取物0.50 g置500 ml容量瓶中，适量50%甲醇水溶液超声溶解，定容至刻度，制成浓度为1 mg/ml的储备液，于冰箱(-20℃)冷冻备用。

2.3 大鼠体内药动学试验

取24只健康SD大鼠，随机分成4组，每组6只，雌雄各半。给药前12 h禁食不禁水，给药后4 h恢复进食。灌胃给药试验组包括低剂量组(50 mg/kg)、中剂量组(100 mg/kg)以及高剂量组(200 mg/kg)；静脉给药试验组统一为单剂量给药(50 mg/kg)。按照预先设计的时间点由大鼠眼底静脉丛采血约0.2 ml，收集在肝素抗凝的1.5 ml EP管中。灌胃给药采血时间点为：给药后5、15、30 min及1、6、8、11、24 h；静脉给药采血时间点为：给药时(0 min)和给药后5、15、30 min及1、6、8、11、24 h。

2.4 血浆样品的处理

精密吸取血浆样品100 μl，加入400 μl甲醇，立即涡旋10 s混匀，离心10 min(10 000 r/min，4℃)后吸取上清液400 μl，35℃下氮气吹干，用100 μl 10%甲醇水溶液复溶，涡旋混匀后离心10 min(10 000 r/min，4℃)，取上清液，LC-MS/MS进样分析。

2.5 血药浓度数据分析与计算

PIEB的药动学参数采用InnaPhase Kinetica2000TM软件(美国)分析处理，并计算相关药动学参数。cmax为最大血药浓度，血药浓度-时间曲线下面积AUC(0→t)由梯形法计算得到，tpeak为给药后血药浓度达峰时间。

3 结果与讨论

3.1 方法学考察

3.1.1专属性与特异性

分别取大鼠空白血浆、大鼠空白血浆与PIEB标准样品混合物以及给予大蒜皂苷总提取物后的大鼠血浆，按照“2.4”项下操作处理。在“2.1”项分析条件下，PIEB的色谱保留时间为3.9 min，色谱分析时间为9 min。给药前空白血浆未检测到PIEB，表明大鼠血浆中的内源性物质对PIEB的分析无干扰。大鼠的空白血浆、PIEB血浆标准品以及大蒜皂苷总提取物给药后血浆色谱图见图1。

3.1.2线性范围与灵敏度

取“2.2”项下PIEB血浆标准样品，按“2.4”项下操作处理，进样分析。以PIEB峰面积Y对浓度X绘制标准曲线，并得到相应的相关系数r值。另取10 ng/ml PIEB血浆标准样品，按“2.4”项下操作处理，进样分析，平行操作6份，根据标准曲线，计算测得浓度，并计算定量下限(LLOQ)的准确度与精密度：线性范围10～2 430 ng/ml；标准曲线方程，Y=-528.677+163.38X(r=0.999 8)，线性关系良好；LLOQ为10 ng/ml时，RSD为6.60%，准确度为105.57%。

3.1.3精密度与准确度

分别用大鼠空白血浆配制低、中、高3个浓度的PIEB血浆标准样品，按“2.4”项下操作处理，每个浓度每日重复6次，连续3 d进样，根据标准曲线，分

别计算标准样品的测得浓度，以其标示浓度为参照，计算测定方法的准确度和日内、日间精密度，结果见表1，表明日内和日间精密度均<15%，准确度在85%～115%之间。

图1 空白血浆(A)、空白血浆+大蒜皂苷PIEB对照品(B)、给药后10 min的血浆样品(C)的色谱图 1.大蒜皂苷PIEB

血浆样品PIEB浓度(ρB/ng·ml-1)日内测得浓度(ng/ml)精密度(RSD,%)准确度(%)日间测得浓度(ng/ml) 精密度(RSD ,%)准确度(%)2021.01±1.577.48105.0620.11±0.452.25100.53200201.00±4.362.17100.50203.84±4.412.16101.922 0002 124.80±31.491.48106.242 132.73±50.772.38106.64

3.1.4样品稳定性实验

分别配制20、200、2 000 ng/ml 3种浓度PIEB血浆标准样品，每个样品各平行操作6份，分别考察上述样本在4℃、25℃保存12 h，反复冻融3次的稳定性。所测结果准确度在90%～110%范围内，RSD均<5%，表明PIEB血浆样品在4℃及室温下保存12 h后稳定，经3次反复冻融后不受影响。

3.1.5提取回收率与基质效应

取6份不同来源的空白大鼠血浆，按“2.4”项下方法处理后，分别加入低、中、高3种浓度PIEB标准液溶液复溶，分别进样，所记录的峰面积为分子；取对应浓度的PIEB对照品标准液分别进样，所记录的峰面积为分母；计算大蒜皂苷PIEB的基质因子。结果显示低、中、高3个浓度的基质效应提取回收率分别为77.86%、67.87%和70.71%，RSD≤8.69%(n=6)，表明该方法无明显的离子效应。取低、中、高3种浓度PIEB，按“2.4”项下处理后，分别进样，所记录的峰面积为分子；取空白血浆，按“2.4”项下处理后，分别加入对应浓度的PIEB标准液复溶，进样后的峰面积为分母，计算大蒜皂苷PIEB的提取回收率，结果显示低、中、高3种浓度大蒜皂苷PIEB在血浆样品中的提取回收率分别为75.92%、82.13%和80.25%，RSD≤4.60%(n=6)。

3.2 PIEB在大鼠体内的药动学

3.2.1大鼠静脉注射大蒜皂苷提取物后PIEB的药动学

根据标准曲线，计算大鼠静脉注射大蒜皂苷提取物后，PIEB的浓度，并绘制平均血药浓度-时间曲线(图2)。

图2 大鼠静脉注射大蒜皂苷提取物后PIEB的平均药-时曲线

所得数据经软件分析拟合，以非房室模型计算得到t1/2、AUC、cmax等药动学参数(表2)。结果表明，大鼠静脉注射大蒜皂苷提取物后，PIEB即刻在

体内达到最大血药浓度，t1/2为322 min左右，平均驻留时间(MRT)为270 min。

3.2.2大鼠灌胃大蒜皂苷提取物后PIEB的药动学

根据标准曲线，计算大鼠灌胃大蒜皂苷提取物后PIEB的浓度，并绘制平均血药浓度-时间曲线(图3)，所得数据经软件分析拟合，以非房室模型计算得到t1/2、AUC、cmax等药动学参数(表2)。给予SD大鼠灌胃低、中、高浓度大蒜皂苷提取物后，PIEB的AUC、cmax等随给药剂量的增加而增大，可初步判定大蒜皂苷PIEB在大鼠体内的药动学过程属于线性动力学过程。

图3 大鼠灌胃大蒜皂苷提取物后PIEB的平均药-时曲线

参数静脉注射(50 mg/kg)灌胃给药(mg/kg)50100200cmax(ng/L)26 364±1 34314.8±3.845.2±57.9134.1±47.2tmax(t/min)—31±4468±9418±14t1/2(t/min)322.4 ±105.5763 ±1 1221 064±7292 191±2 243CL[ml/(min·kg)]30.3±12.913 730±9 82512 570±12 14810 001±8 524V(ml/kg)6 750±1 0624 710 517±1 331 7826 665 925±1 853 14711 895 277±7 931 275MRT(t/min)270±167938±1 5001 267±1 0612 915±3 085AUC(0-t)(ng·min /ml)1 922 048±933 6891 753±5043 688±9769 504±5 295AUC(0-∞)(ng·min /L)2 008 232±1 065 882 7 710±9 76116 992±12 99836 324±26 108

注：V为表观分布容积

4 讨论

笔者在实验中处理血浆样品时，曾采用甲醇、乙腈来沉淀蛋白，均因基质效应太强，导致大蒜皂苷提取物中PIEB的响应太低，本实验采取的前处理方法，提取回收率高，无明显基质效应，适用于大蒜皂苷提取物血浆样品的预处理[9-10]。

本实验建立并验证了测定大蒜皂苷提取物中PIEB的LC-MS/MS方法。药动学研究表明静脉给药大蒜皂苷总提物50 mg/kg 后，PIEB即刻在体内达到最大血药浓度，其t1/2为322 min左右，MRT为270 min；SD大鼠灌胃低、中、高浓度大蒜皂苷提取物后，PIEB的AUC、cmax等随给药剂量的增加而增大，可初步判定大蒜皂苷提取物中的PIEB成分在大鼠体内的药动学过程属于线性动力学过程，灌胃给药结果表明大蒜皂苷提取物中的PIEB成分在大鼠体内的生物利用度极低。