刘 姣，云春美，金朝仙，李美玲，杨 鸿，倪广惠

(云南中医学院 中药学院，云南 昆明 650500)

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNAs)是一组长度超过200个核苷酸的RNA，不参与蛋白质或多肽的编码[1].目前，对于LncRNAs的认识尚处于初级阶段，LncRNAs与药物具有关联[2]，一些LncRNAs在肿瘤细胞中表达出现异常，如MALAT1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)[3]在肿瘤细胞中表达上调并促进肿瘤转移，MALAT1缺失小鼠乳腺癌转移减少；NEAT1(Nuclear enriched abundant transcript 1)对于人类的非小细胞肺癌的增殖、恶化[4]和发病机制[5]中起重要作用.

灯盏乙素是云南特色民族药灯盏细辛Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand -Mazz的主要有效活性成分，在临床上用于治疗心血管疾病.越来越多研究发现灯盏乙素具有潜在的治疗肿瘤的作用[6-7]，其作用机制尚不明确，目前未有灯盏乙素对肿瘤细胞中lncRNAs的影响的研究.通过研究灯盏乙素对乳腺癌MDA-MB-231细胞的lncRNAs的表达的影响，进一步阐述灯盏乙素对肿瘤细胞的分子作用机制.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

灯盏乙素(纯度>98%，云南红河千山生物工程有限公司，批号：20150216)；RPMI-1640培养液(美国Hyclone公司)；CellTiter 96®Aqueous细胞增殖检测试剂盒(上海普洛麦格生物产品有限公司)；胎牛血清(兰州百灵生物技术有限公司)；青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司)；RNAiso试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(瑞士Roche公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；LightCycler®96实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司).

1.2 细胞培养

乳腺癌MDA-MB-231细胞购自于中国科学院昆明动物研究所.肿瘤细胞用RPMI-1640培养液培养，加入10%胎牛血清、100 mg/mL链霉素.细胞于37℃、5%CO2进行培养.

1.3 细胞增殖实验

取对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，每孔1000个细胞一共加入培养基100 μL，置CO2培养箱37℃中孵育24 h充分贴壁以后，每孔加入25 μL的含有灯盏乙素的培养基使其终浓度为1、10、25、50、100 μmol/L，其中第3天时候换液，最终灯盏乙素作用于细胞一共5 d.测定时每孔加入CellTiter 96®Aqueous细胞增殖检测试剂25 μL，再在37℃培养箱中孵育1 h.Bio-Rad680型酶标仪490 nm测吸光度.每组设6复孔，每个实验分别重复3次.

1.4 实时PCR分析

取对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于6孔板，每孔7.5×104个细胞，置CO2培养箱37℃中孵育，接种24 h后加入灯盏乙素.用药组受试物溶液终浓度分别为1、10、25、50、100 μmol/L.对照组加入等量PBS溶液；每组设3复孔，放入37℃CO2培养箱中.每个实验分别重复3次.

细胞培养5 d后，使用RNAiso试剂盒(Takara)，按照说明书对细胞进行总RNA提取.利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA(1～2 mg)进行cDNA合成，使用罗氏FastStart Essential DNA Green Master和罗氏LightCycler 96®进行荧光定量检测，PCR引物如表1所示.用β-actin作为对照.条件为1、95℃ 120 s，2、95℃ 10 s，3、60℃ 10 s，4、72℃ 10 s，2～4步骤一共45个循环，使用2-ΔΔCt表示基因相对表达量，2-ΔΔCt的计算方法ΔCt=Ct目的-Ct内参，-ΔΔCt=-(ΔCt处理-ΔCt对照).

表1 PCR引物

1.5 统计学处理

对照组和处理组采用t检验或方差分析.以α=0.05作为检验水准，p<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 灯盏乙素对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用

将乳腺癌MDA-MB-231细胞置于96孔板中，用不同浓度的灯盏乙素处理5 d.如图1所示,灯盏乙素低浓度(1、10和25 μmol/L)时促进了细胞增殖.10 μmol/L时促进作用最强.相反，在50和100 μmol/L的高浓度时，灯盏乙素则会抑制细胞增殖.随着剂量上升，灯盏乙素对细胞增殖的促进作用在10 μmol/L以下是逐渐增强，而超过 10 μmol/L 时则减小.当浓度在50 μmol/L以上时，则会转变为抑制作用.

2.2 灯盏乙素对乳腺癌MDA-MB-231细胞中LncRNA的影响

检测了LncRNAs中MALAT1、NEAT1基因表达的变化.MALAT1(图2A)和NEAT1(图2B)的基因表达水平在1、10、25和50 μmol/L显著低于对照组(p<0.05)，而在100 μmol/L时显著高于对照组(p<0.05).

在1 μmol/L～25 μmol/L时，MALAT1、NEAT1的基因表达随着剂量的增加而逐渐下调.相反，在100 μmol/L时，2种lncRNAs的基因表达上调.

此外，还测了在不同浓度灯盏乙素处理以后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中p53基因的mRNA表达(图2C).p53基因的mRNA表达在50 μmol/L及其以下是显著下调(p<0.05)，而在100 μmol/L浓度下显著上调(p<0.05).

3 讨论

文献[8]研究表明灯盏乙素在小于10 μmol/L的剂量下不会诱导NaMalwa细胞凋亡，在15 μmol/L或以上时会诱导其凋亡.本研究显示灯盏乙素在10 μmol/L时(图1)对细胞增殖有明显的促进作用.当剂量小于10 μmol/L时，促进作用增强.在50 μmol/L以上时，促进作用转化为抑制作用.灯盏乙素在100 μmol/L剂量时对肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用.

灯盏乙素能抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，并伴随着基因和蛋白的表达发生改变.本研究结果表明灯盏乙素对MALAT1,NEAT1和p53基因的表达有一定的调节作用，其结果与增殖作用类似，MALAT1,NEAT1和p53基因的表达水平在低剂量时下调，而在100 μmol/L高剂量时显著上调.

Li等[9]的研究表明，灯盏乙素降低了人体肿瘤细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2的表达.Han等[10]的研究显示了MALAT1的过度表达明显降低了MMP-2的表达水平.本研究证明了灯盏乙素在100 μmol/L时，明显上调了MALAT1的表达水平(图2A).同时，灯盏乙素在100μmol/L时，通过上调MALAT1的表达水平来降低MMP-2的表达水平，从而抑制了肿瘤细胞的增殖.灯盏乙素是如何调节LncRNAs的表达有待进一步研究.

灯盏乙素在100 μmol/L时显著上调了p53基因的mRNA表达(图2C).据报道，灯盏乙素在100 μmol/L时通过调节p53的基因表达，从而增强了caspase-6蛋白的活性[11].

综上所述，本研究显示灯盏乙素对乳腺癌MDA-MB-231细胞中的LncRNAs MALAT1,NEAT1和p53基因的表达均产生影响，为进一步深入探索LncRNAs的作用机制提供了依据，并且有助于从分子水平阐明灯盏乙素对肿瘤的作用机制.