王会琴，周晓青，刘世坤，刘志朋，殷 涛，2*

（1.中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津 300192；2.中国医学科学院神经科学中心，北京 100730）

0 引言

在脑科学与神经科学研究中，物理刺激（如电刺激、磁刺激、光刺激和超声刺激）发挥着愈加重要的作用[1-4]。其中，经颅磁刺激（transcranial magnetic sti-mulation，TMS）是目前应用最广泛的电磁刺激技术，该技术利用变化的磁场诱发感应电流进而对神经组织进行调控，具有安全无创、矢量性刺激的特点[3]。TMS不仅广泛应用于神经疾病的治疗，如抑郁症[5-6]、癫痫[7-8]等，还可以用于脑认知活动与功能区定位。由于理论上电磁场遵循拉普拉斯方程，即TMS线圈的场强无法存在一个局部的极大值（聚焦点）[9]，因此难以实现毫米量级磁场或电场的聚焦，其刺激深度也局限于对皮层的刺激。经颅超声刺激（transcranial ultrasound stimulation，TUS）作为一种新型的神经调控技术[10]，将低强度的超声聚焦作用于脑部靶区，利用超声声束的机械效应对脑部进行无创的神经刺激，是一种力学调控。TUS因具有非侵入性、高空间分辨力、可实现深部刺激等潜在特点引起愈加广泛的关注与研究[11]。而经颅磁声刺激（transcranial magneto-acoustical stimulation，TMAS）是一种基于磁声耦合原理的神经调控技术，它利用超声的聚焦性可实现毫米级空间分辨的聚焦电刺激，可对神经电活动进行直接调控。该方法在保证刺激深度的情况下可获得更好的定位和脑功能区靶点刺激，特别是对刺激靶向性要求更高的脑功能分区领域以及深部经颅精准刺激领域具有重要的研究价值和应用前景[12]。

2003年Norton[9]首次提出可以利用磁声耦合原理将超声聚焦性与深穿透性的优势应用于电刺激，并对该设想进行了理论推导。理论计算表明该方法可以产生相应的感应电场和电流，并作用于目标靶区。2006年杨少华[13]分别对静磁场中带电凝胶受超声作用而产生的电信号以及超声信号回波做了频谱分析，初步验证了超声电刺激方法的可能性。2016年李慧雨等[14]以铜线为样本，对置于不同声场位置的铜线样本产生的电场的频率、幅值和分布进行了仿真和实验，验证了待刺激样本中会产生与声场、静磁场方向均正交的感应电场，且感应电场与超声换能器声场分布一致；同年，Yuan等[15]基于Hodgkin-Huxley神经模型对TMAS进行了仿真计算，对刺激参数进行了推导，为TMAS技术提供了理论基础。

TMAS与TUS的技术原理不同，TMAS是在TUS的基础上引入静磁场，通过磁声耦合原理产生电刺激的同时还叠加了声刺激的作用。因此，分析对比TMAS与TUS的作用效果，对探究TMAS的作用机制至关重要。

肌电信号（electromyography，EMG）是一种微弱的生物电信号，幅值一般为毫伏级，该信号与神经肌肉活动密切相关，可作为评价运动皮层兴奋性的重要指标[16]。因此在探究TMAS与TUS技术对小鼠运动皮层的调控作用时，选用EMG作为评价指标可以直观地观察运动皮层的兴奋性，进而评价TMAS与TUS对神经组织的调控效果和作用方式。为研究TMAS相对于TUS对皮层神经活动的调节作用，本研究通过对小鼠EMG的采集与分析，对比了二者诱发的小鼠皮层运动阈值的差异，进而分析了二者的影响差异及其潜在的作用机制。

1 方法

1.1 TUS与TMAS的原理

TUS技术原理是低强度超声波可以无损害地穿透包括颅骨在内的生物组织，并基于超声的高聚焦性可将能量聚焦在极小的区域，利用超声的机械效应兴奋或抑制细胞活动[17]，可实现无创性与高分辨力的经颅神经刺激。TMAS技术原理是基于导电组织中带电离子的霍尔效应，导电组织中的带电离子在超声波的作用下发生振动，由于外加静磁场的存在，振动的离子切割磁感线在超声激励与静磁场的矢量积方向产生洛伦兹力，洛伦兹力促使带电的正负离子向相反的方向移动，即可实现神经调控所需的刺激电场和电流[15]。TMAS原理如图1所示。

图1 TMAS原理图

在静磁场B的作用下，当超声波带动导电组织产生相同振动速度v的运动时，导电组织中产生的电场E为

且组织中粒子振动的速度v与超声声压P之间的关系为

式中，ρ为组织密度，Cs为组织中超声传播速度。

通过公式（2）可看出，由于神经组织中ρ与Cs不变，TMAS产生的刺激电场仅与磁场强度和声压有关，且该电场方向为静磁场与声束振动方向的矢量积方向；而在磁感应强度恒定时，电压与超声声压成线性关系。

1.2 小鼠TUS-TMAS系统

为了进行在体小鼠的TUS与TMAS对比实验，本研究搭建了一套小鼠TUS-TMAS一体化实验系统，该系统包括超声激励发生装置、静磁体、小鼠固定装置以及EMG采集与分析装置，如图2所示。

图2 TUS-TMAS系统示意图

在TUS-TMAS系统中，首先由信号发生器A（TFG6920A，数英，中国）产生特定重复频率（pulse repetition frequency，PRF）的脉冲触发信号，用于调制信号发生器 B（AFG3252，Tektronix，美国）；信号发生器B用于产生特定幅值及宽度的脉冲串。调制后的超声信号经由功率放大器（HSA4101，NF，日本）放大后激励超声换能器（V301，Olympus，日本），该换能器为平面型超声换能器，中心频率500 kHz，带宽300 kHz。换能器发射的超声波经声准直器聚焦，对实验小鼠脑部靶区进行刺激。实验中，待刺激小鼠被固定于脑立体定位仪（SR-6M，成茂，日本）上，使用呼吸麻醉机（R580S，RWD，中国）对实验小鼠进行轻度气体麻醉。表面磁感应强度为0.3 T的静磁铁放置在实验小鼠旁的旋转移动支架上，以提供TMAS实验需要的静磁场。实验中，可通过旋转支架控制磁场的施加与撤除，分别实现对小鼠的TMAS和TUS过程。静磁铁的表面磁感应强度通过高斯计（Model 475，Lakeshore，美国）测试获得。此外，为了确定实验中的声学参数，设置了声场检测装置。针式水听器用于检测待刺激靶区的声信号，该声信号经可变增益放大器（5072PR，Olympus，日本）由数字示波器（MSO4104，Tektronix，美国）显示。实验中，使用多通道生理电信号采集处理系统（RM6240E/EC，成仪，中国）对小鼠EMG进行采集、放大及简单滤波。EMG的后期分析、处理使用MATLAB工具包。

1.3 参数选择与刺激靶点处声压检测

参照Tufail等[18]研究中的相关数据，综合考虑超声强度以及磁声耦合电场强度的安全性和有效性，本实验中所使用的超声参数如下：基波频率f=500 kHz，基波周期Nc=300，重复频率PRF=1 kHz，脉冲群重复数NTB=400，周期T=4 s。功率放大器放大倍数为100倍。

TMAS是否能够有效地作用于目标靶区，除了观察实际运动反馈和EMG采集之外，还需要进行量化分析。另外，在使用超声进行颅内实验时，超声的热效应、机械效应以及空化效应等是否会引起神经组织的损伤也是需要考虑的因素。因此，对于目标脑区的实际超声强度的测量评估是非常重要的[19]。

为了获得超声激励下小鼠刺激靶点处的真实声压，参考Younan等[20]研究设计了以下实验：将头部脱毛的小鼠在脑立体定位仪上进行固定，带有声准直器的超声换能器通过耦合剂与头部接触，在颅内形成刺激点，记录刺激靶点的空间坐标。移出小鼠，保持超声换能器位置不变，将针式水听器置于移出前小鼠头部的刺激靶点处。在保证测试灵敏度的前提下，调整针式水听器方向，使其与超声换能器的聚焦声束方向一致。示波器同步检测超声发射信号与针式水听器接收信号，从而得出在超声脉冲发射时，小鼠刺激靶点的真实声压。按照EMG检测实验要求改变超声换能器的激励电压，再根据空间峰值时间峰值声压（Psptp）可得到在不同激励电压下针式水听器检测到的靶点处真实声压，即小鼠脑皮层刺激靶点处的真实声压Psptp。Psptp计算公式如下：

其中，UL为测得输出电压最大瞬时值，ML为水听器灵敏度，本实验中ML约为2 μV/Pa。得到激励电压与小鼠刺激靶点处声压值曲线，如图3所示。

图3 激励电压-刺激靶点处声压曲线

1.4 EMG的采集与分析

EMG的检测电极一般分为表面贴片式电极与针型插入式电极（下文简称“针式电极”）。针对本研究中使用的C57BL/6J小鼠，贴片式电极面积较大，灵敏度较低，无法有效采集EMG，因此本研究选用了针式电极。针式电极接入4通道记录仪——RM6240E/EC，记录仪输出口与主机相连，实现EMG的实时采集、显示与记录。由于小鼠EMG微弱，并且使用针式电极对小鼠的EMG进行采集时会引入干扰与噪声，所以本研究对采集到的小鼠EMG首先要进行低通滤波处理，然后应用小波变换对EMG进行分析，其中小波基为db5小波，分析波形如图4所示。

图4 小鼠EMG与TMAS激励信号关系

1.5 实验方案

本研究用鼠为C57BL/6J（雄性，体质量25～30 g，7～8周龄），6只，对每只小鼠先进行TUS后进行TMAS，分别采集2种刺激方式下的EMG。在实验前剃除头部毛发，以更好地与超声探头耦合。为保证实验过程中小鼠状态的稳定，先使用呼吸麻醉机对小鼠进行轻度气体麻醉，再通过腹腔注射水合氯醛（4%，0.05 ml/10 g）进行麻醉，一般10～15 min可渐渐苏醒到较稳定的浅麻醉状态[21]。

将麻醉后的小鼠固定在脑立体定位仪上，将涂有耦合剂的超声换能器与刺激的目标靶区（运动皮层）相接触。由于肌电采集仪自带的针式电极直径偏大，不利于微小信号的精确采集，本实验将针灸针进行改进作为采集的针式电极，在小鼠右前肢远心端的肌肉组织插入经改进的EMG针式电极，并在小鼠两后肢分别插入针式电极作为参考极和共地端，通过电极采集小鼠肢体运动部位的EMG并传到主机进行处理。

实验步骤：（1）在TUS系统中对小鼠的运动皮层进行TUS，获得与刺激同步且稳定的运动反馈，并可在主机上实时观察EMG。（2）逐渐降低超声刺激的强度——空间峰值时间平均声强（Ispta），直至无同步运动反馈以及EMG，该过程中能够引起有效运动反馈以及EMG的最小超声强度即为TUS诱发的运动阈值。（3）在TUS系统中引入静磁场，构成TMAS系统，重复上述操作过程，得到TMAS诱发的运动阈值。

实验过程中，除了对小鼠EMG进行观察，还辅以运动反馈记录。记录一段时间内刺激能够成功诱发肢体运动反应并采集到EMG的次数，计算成功诱发次数占总激励次数的比例，即EMG成功率[22]。

2 结果及分析

（1）当Ispta＞144 mW/cm2时，TUS 与 TMAS 均能诱发小鼠的运动阈值，但TMAS能引起较稳定的运动反馈。

实验中发现：在TUS作用时，小鼠可以在信号发生器B的输出电压最低为400 mV时诱发运动反馈，即小鼠在信号发生器B幅值为400 mV时获得运动阈值；而在TMAS作用时，可在信号发生器B幅值降低到200mV时获得运动阈值。对原始信号进行滤波、放大等处理后，得到在信号发生器B输出电压为400mV时TUS与TMAS诱发的EMG，如图5所示。由图3可知，当信号发生器B输出电压为400 mV时，实验小鼠的真实颅内声压约为60 kPa。空间峰值时间峰值声强（Isptp）、Psptp和Ispta的关系如下：

其中，ρc为声阻抗，这里取平均软组织声阻抗，即1.5×106Pa·s/m[20]。由公式（4）、（5）可得，在声压Psptp为 60kPa时，声强Ispta为 144 mW/cm2。

图5 信号发生器B输出电压均为400 mV时，TUS与TMAS诱发的EMG

实验可得，当Ispta＞144 mW/cm2时，TUS 与 TMAS均能诱发小鼠的运动阈值。同时运动反馈的记录结果表明，在Ispta达到144 mW/cm2时，TUS诱发EMG的成功率为50%～60%，而TMAS诱发EMG的成功率却达到80%～90%。这表明在均能诱发运动阈值的声强范围内，TMAS诱发EMG成功率更高，可获得更稳定的运动反馈。

（2）当 25 mW/cm2＜Ispta＜144 mW/cm2时，仅 TMAS能诱发小鼠的运动阈值，引起运动反馈。

当信号发生器B输出电压分别为300和200mV时，对TUS与TMAS诱发的EMG进行滤波等处理后的结果如图6所示。可以看出信号发生器B的输出电压降低到200 mV时TMAS仍可诱发小鼠的运动阈值。即TMAS可以在声强Ispta达到25 mW/cm2时引起小鼠的运动反馈，同时检测到在声强Ispta为25mW/cm2时诱发小鼠EMG成功率为50%～60%，这与Ispta=144 mW/cm2时TUS的作用效果类似。该结果表明，TMAS可以在更低强度的超声作用下，兴奋小鼠的运动皮层，诱发小鼠EMG并获得运动阈值。

图6 信号发生器B输出电压分别为300和200 mV时，TUS与TMAS诱发的EMG

（3）当Ispta＜25 mW/cm2时，TUS 与 TMAS 均未能诱发小鼠的运动阈值。当信号发生器B输出电压均为100 mV时，对TUS与TMAS诱发的EMG处理后的结果如图7所示。

图7 信号发生器B输出电压均为100 mV时，TUS与TMAS诱发的EMG

进一步降低超声强度，发现当信号发生器输出电压低于200 mV时，即Ispta＜25 mW/cm2时，TUS与TMAS均不能兴奋小鼠的运动皮层，诱发小鼠EMG。

从结果可知：TUS作用下，能够诱发小鼠的运动阈值的最低超声强度Ispta为144 mW/cm2；而TMAS作用下，能够诱发运动阈值的最低超声强度Ispta为25 mW/cm2，超声强度降低了约80%。

3 总结及讨论

本文基于小鼠EMG的采集、分析及运动阈值的获取，对比研究了TUS与TMAS对运动皮层神经的调控效果。结果表明：相对于TUS，TMAS可以在更低的超声强度下诱发小鼠的EMG并检测到运动阈值；并且在相同超声强度激励下，TMAS引起EMG的成功率更高，运动反馈也更加稳定。该结果反映出TMAS较TUS具有更有效的小鼠脑皮层运动区调控能力，其原因是TMAS结合了耦合电场与声场的复合刺激，同步的声场与电场形成了协同调控[23]。

此外，有研究表明，小鼠在TUS作用下能够诱发运动反馈的最低超声强度Ispta不低于100 mW/cm2[16]。但是，本研究结果表明TMAS可以将能够引起运动反馈的超声强度Ispta降低约80%，这很大程度上可以降低超声的热效应和空化效应给神经组织可能带来的损伤。同时对TUS的研究也具有重要意义。本研究中还观察到：对于TMAS，在磁场引入与撤除的一小段时间内（3～10 s），观察到小鼠EMG的成功率相对于持续进行磁场刺激时更高，这可能是由于神经元细胞存在一定的磁效应[19]，使得神经元细胞膜导电性改变或者阈电位降低。此外，本研究仅选取了EMG作为评价指标，为进一步探究TMAS对神经电活动的影响，下一步还可对小鼠的局部场电位、神经电生理等信号进行分析研究，更深入地探索TMAS对神经元细胞的刺激原理与作用机制。