蒋舒娜，蒋丽娟，邵小南

（江苏省常州市第一人民医院 1.检验科，2.核医学科，江苏 常州 213003）

最新的癌症统计发现，乳腺癌占女性新发癌症的15%，在30～59岁女性中，乳腺癌是最常见的癌症，乳腺癌是45岁以上女性癌症死亡的主要原因，其次是肺癌。中国近几十年来肥胖和缺乏活动发生率增加，可能是影响乳腺癌发病率的主要原因[1]。在晚期乳腺癌中，骨转移的发生率为65%～75%，而首发症状为骨转移者占27%～50%[2]。

ORLANDI等[3]发现，相对于健康对照组，乳腺恶性肿瘤和乳腺良性病变患者的Hepcidin均增高。CINISELLI等[4]也发现，与良性乳腺疾病比较，乳腺癌的Hepcidin明显升高，证实了Hepcidin在乳腺癌诊断的潜在作用。然而，Hepcidin与乳腺癌骨转移的相关研究较少。本研究通过分析乳腺癌及乳腺癌骨转移患者的Hepcidin、骨形态发生蛋白6（bone morphogenetic protein 6, BMP-6）、白细胞介素 6（Interleukin 6, IL-6）、可溶性转铁蛋白受体（human soluble transferrin receptor,sTfR）及血红蛋白（Hemoglobin, Hb）等相关指标，探讨Hepcidin在乳腺癌发生、发展中的作用，以指导临床决策。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2013年6月—2014年3月江苏省常州市第一人民医院乳腺癌骨转移患者25例，乳腺癌无骨转移患者30例及乳腺增生患者30例。3组患者年龄匹配，年龄55～75岁，平均66岁。所有患者均经手术或病理确诊，所有乳腺癌患者均经过放射性核素扫描（ECT）初筛，并X射线、CT或MRI明确有无骨转移。排除影响因素：骨代谢疾病、急性炎症反应（CRP＞6 mg/L）、肝功能异常（凝血酶原时间和谷丙转氨酶异常）及心肺疾病病史。

1.2 试剂及仪器

Sysmex XE2100血细胞分析仪及试剂购自日本Sysmex公司，血清Hepcidin、BMP-6、IL-6及sTfR检测试剂盒购自美国R&D公司，酶标仪、洗板机购自美国Biorad公司。

1.3 血常规、血清Hepcidin、BMP-6、IL-6、sTfR的检测

隔夜空腹，于8∶00～10∶00收集血样，防止Hepcidin的昼夜波动[5]，分别注入EDTA抗凝管（2 ml）和血清管（3 ml）。血常规在2 h内检测；血清管3 000 r/min离心30 min分离血清，置入-80℃冰箱冷冻保存。按试剂盒说明书操作，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）分别检测血清标本中Hepcidin、BMP-6、IL-6、sTfR的含量（Hepcidin检测范围15.6～1 000 pg/ml，BMP-6检测范围156.00～10 000 pg/ml，IL-6检测范围3.1～300 pg/ml，sTfR检测范围3.0～80 nmol/L）。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，各组数据做正态性检验及方差齐性检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布且方差齐的数据比较采用单因素方差分析，组内两两比较用LSD-t检验，方差不齐的数据比较用非参数Mann-WhitneyU检验；ROC曲线比较各指标对乳腺癌骨转移的诊断价值，多因素Logistic回归分析比较各指标在乳腺癌骨转移的作用，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者年龄、Hepcidin、IL-6、Hb、BMP-6、sTfR比较

3组患者平均年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）；3组患者 Hepcidin、IL-6、Hb、BMP-6、sTfR比较差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

表1 3组患者年龄、Hepcidin、IL-6、Hb、BMP-6、sTfR的比较 （±s）

表1 3组患者年龄、Hepcidin、IL-6、Hb、BMP-6、sTfR的比较 （±s）

注：3组患者Hepcidin、IL-6、Hb比较采用单因素方差分析，BMP-6、sTfR因不符合方差齐性，采用非参数检验

组别 n 年 龄 /岁 Hepcidin/（pg/ml） IL-6/（pg/ml） Hb/（g/L） BMP-6/（pg/ml） sTfR/（nmol/L）乳腺癌骨转移组 25 65.2±7.8 86.37±16.30 17.45±5.42 110.58±20.13 498.40±193.77 5.03±0.69乳腺癌无骨转移组 30 63.6±9.7 47.21±18.48 12.13±6.36 132.44±17.78 335.26±179.83 7.21±0.70乳腺增生组 30 62.7±8.9 34.31±16.79 10.80±5.92 149.96±14.09 309.13±35.85 7.80±5.35 F/H值 0.161 65.733 9.313 35.185 15.632 26.411 P值 0.851 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3组患者Hepcidin、IL-6及Hb比较差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较后发现，对Hepcidin，乳腺癌骨转移组＞乳腺癌无骨转移组＞乳腺增生组；对IL-6，乳腺癌骨转移组＞乳腺癌无骨转移组及乳腺增生组，但乳腺癌无骨转移组与乳腺增生组比较，差异无统计学意义（t=0.834，P=0.406）；对Hb，乳腺癌骨转移组＜乳腺癌无骨转移组＜乳腺增生组。

3组患者BMP-6、sTfR比较差异有统计学意义（P＜0.05）。对BMP-6，根据平均秩次（59.08 VS 38.77 VS 33.83），乳腺癌骨转移组＞乳腺癌无骨转移组＞乳腺增生组；对sTfR，根据平均秩次（23.50 VS 44.52 VS 57.73），乳腺癌骨转移组＜乳腺癌无骨转移组＜乳腺增生组。见图1、2。

2.2 Hepcidin、BMP-6、IL-6对乳腺癌骨转移的诊断价值

Hepcidin、BMP-6、IL-6对乳腺癌骨转移的诊断ROC曲线见图3，各项参数见表2，Hepcidin用于乳腺癌骨转移的诊断价值最高。

2.3 乳腺癌骨转移的影响因素

以乳腺癌是否骨转移为应变量（骨转移Y=1，无骨转移Y=0），Hepcidin、BMP-6、IL-6、sTfR及Hb赋值后为自变量进行多因素Logistic回归分析。在回归方程中有意义的指标有两项，为Hepcidin和sTfR；Hepcidin为骨转移危险因素，sTfR为保护因素。主要影响因素结果见表3。

图2 3组患者的sTfR比较 （±s）

图3 Hepcidin、BMP-6、IL-6用于乳腺癌骨转移诊断的ROC曲线

表2 Hepcidin、BMP-6、IL-6用于乳腺癌骨转移诊断的各项参数

表3 乳腺癌骨转移多因素Logistic回归分析参数

3 讨论

既往研究发现，Hepcidin升高与多种癌症有关，如多发性骨髓瘤、前列腺癌、肾细胞癌[6-9]。PINNIX等[10]的研究突出了膜铁转运蛋白（FPN）和Hepcidin在乳腺癌细胞铁稳态失衡起重要作用。这些作者第一次表明，在培养的乳腺癌细胞，Hepcidin通过转录后机制负调控FPN表达；此外，在肿瘤细胞中的Hepcidin浓度高于正常细胞。近期的相关研究发现，乳腺癌患者与健康对照组比较，血浆Hepcidin浓度更高[3，11]，Hepcidin可以负性调节癌细胞FPN的表达。CINISELLI等[4]也发现，与良性乳腺疾病相比，乳腺癌的Hepcidin明显升高。本组资料中，乳腺癌患者无论有无骨转移，Hepcidin水平均高于乳腺增生组，与上述观点相符。

为什么乳腺癌患者血浆Hepcidin升高？由铁状态、促红细胞生成活性、炎症，以及每个独立信号的相对强度形成相互作用的通路来决定肝脏Hepcidin表达上调（包括BMP-6/SMAD4通路和IL-6/ STAT3通路）[3]。Hepcidin升高可能是由于炎症刺激或肿瘤分泌物IL-6升高了血清铁或依赖BMPs提供的信号。机制研究也发现，增加铁、BMP-6和IL-6能共同促进肝脏Hepcidin的合成[11]。

BMP-6是BMPs家族成员，属于转化生长因子β。BMP已经被发现与多种癌症如乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤和卵巢癌相关。特别是多发性骨髓瘤的血清BMP-2水平会升高[7]。先前研究已经表明，BMP-6在原发性乳腺癌标本和细胞株表达，是癌细胞生长和迁移的抑制剂[12]。本组资料中，乳腺癌BMP-6水平高于乳腺增生组，且有骨转移组更高，说明BMP-6不仅与乳腺疾病的良恶性相关，与骨转移也有很大关系。

IL-6作为细胞因子的核心成员，由淋巴细胞、单核细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞以及某些肿瘤细胞产生，对肿瘤细胞的增殖有重要影响。杨士军等[13]的研究结果显示，IL-6在健康对照组和无骨转移组患者血清中都具有一定水平，但都没有超过150 pg/ml（试剂盒提供的正常上限），而骨转移组患者血清IL-6水平明显高于无骨转移组和健康对照组，推测转移的肿瘤细胞自身产生IL-6，提示IL-6参与乳腺癌骨转移的病理过程。本组资料中，乳腺癌骨转移组IL-6高于无骨转移组和乳腺增生组，支持上述观点。

在晚期乳腺癌中，骨转移的发生率为65%～75%[14-15]，而首发症状为骨转移者占27%～50%，一旦发生骨转移，疾病进入不可治愈的阶段，因此骨转移决定乳腺癌患者的预后。薛东等[16]发现血清Hepcidin可以作为诊断前列腺癌骨转移的敏感指标，同时可以作为预后随访指标，判断治疗疗效。PINNIX等[10]也发现在乳腺癌人群中伴随高FPN和低Hepcidin表达的患者预后较好，95%存活5年无复发。相反，高Hepcidin表达与预后差相关，较低的肿瘤FPN水平也有类似结果。Pinnix用无转移生存率的多因素分析证实了FPN和Hepcidin独立的预后价值。

然而，国内外缺乏对Hepcidin与乳腺癌骨转移的直接研究。杨士军等[13]发现IL-6与乳腺癌骨转移相关。本组资料ROC曲线分析发现Hepcidin对乳腺癌骨转移诊断有较高的价值，且优于BMP-6及IL-6。进一步多因素分析结果，Hepcidin为乳腺癌骨转移危险因素，sTfR为保护因素。上述结果证实Hepcidn不仅可以诊断乳腺癌骨转移，还可以作为乳腺癌预后随访指标。通过BMP-6拮抗剂和IL-6单抗能降低Hepcidin的表达，也许可作为治疗手段，改善体内微炎症状态和铁代谢，延缓乳腺癌骨转移的进展，纠正肿瘤晚期贫血[17]。

综上所述，Hepcidin与乳腺癌骨转移有较好的相关性，但由于本研究为小样本回顾性研究，其诊断价值还需要进一步研究。同时期待Hepcidin对于乳腺癌及乳腺癌骨转移有潜在的治疗价值。