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(1.南阳理工学院 生物与化学工程学院，河南 南阳 473004；2.河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473004)

淀粉酶是催化水解淀粉和糖原的一类酶，是实现工业化生产最早的酶制剂品种，也是迄今为止用途最为广泛、产量最大的酶制剂品种[1]。淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶，不同的淀粉酶有不同的作用方式[2]。α-淀粉酶广泛存在于主要分布在动植物和微生物中，其中微生物来源的淀粉酶占绝大部分，目前报道产生α-淀粉酶的微生物有米曲霉(Aspergillusoryzae)[3]、米根霉(Rhizopusoryzae)[4]芽孢杆菌(Bacillus)[5-8]等。本研究从土壤中分离到一株产α-淀粉酶活力较高的菌株Y1，经形态学及16SrDNA鉴定其为蜡样芽孢杆菌(B.cereus)，并对其酶活进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品

土样取自南阳理工学院校园开水房附近土壤，食堂附近土壤，校园操场草地土壤，荷花池附近土壤，树林间土壤等共计10份土样。除去表层浮土，10～30cm处取样，取回后立即对土样进行分离。

1.1.2 主要试剂与仪器

试剂：可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、琼脂粉等均为生物纯，北京奥博星；葡萄糖、碘化钾、I2、 MgSO4·7H2O、 KH2PO4等均为分析纯，天津科密欧；细菌DNA基因组提取试剂盒DP302，北京天根；PCR及电泳所用试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

仪器：上海一恒LRH-250生化培养箱；常州国华HH-3A控温水浴锅；上海安亭飞鸽TGL-16G高速台式离心机；德国艾本德Eppendorf 5430R高速冷冻离心机 ；上海申安LDZX-50KBS高压灭菌锅；奥林巴斯CX31三目显微镜；BioDrop超微量紫外可见分光光度计；德国艾本德Eppendorf Mastercycler PCR仪；北京六一DYY-7C电泳仪；北京六一DYCP-31DN琼脂糖水平电泳槽；北京君意东方JY04S-3E凝胶成像分析仪。

1.1.3 培养基

富集培养基(g/L):1.2%可溶性淀粉、0.8%蛋白胨、0.2%酵母粉、0.05%MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4。筛选与斜面保藏培养基(g/L)： 1.2%可溶性淀粉、0.8%蛋白胨、0.2%酵母粉、0.05% MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4、1.5%琼脂。发酵培养基： 1.5%可溶性淀粉、1.0%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.05%MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4。以上培养基配制完成后调整pH值至7.0后高压蒸汽灭菌，121℃，20min。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

准确称取每份土壤样品5g，放入有100mL的富集培养基和小玻璃珠的250mL三角瓶中，震荡至土壤分散均匀后置于恒温摇床37℃，180r/min富集培养48h。将富集完成后的发酵液用无菌生理盐水进行梯度稀释，得到10-1～10-6稀释度的稀释液，用移液器依次吸取10-1～10-4样品稀释液各200μL至淀粉筛选培养基上，用涂布器将稀释液在平板上涂布均匀。将涂布完成的平板平放于桌20～30min至液体完全吸收后转入37℃恒温培养箱倒置培养。

1.2.2 产淀粉酶菌株筛选

37℃培养48h后，对各个稀释度涂布平板进行观察，对单一菌落较多的平板用卢戈氏碘液进行染色，选择有较大透明圈的菌落利用划线分离法进行二次纯化；二次纯化后观察平板上菌落是否单一，再次进行染色验证，挑取仍产生透明圈的单菌落接种至斜面上保存。

1.2.3 产淀粉酶菌株鉴定

首先对保藏菌株进行菌落形态观察，并对其进行革兰氏染色镜检形态观察，然后利用天根细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，在BioDrop超微量紫外可见分光光度计于260nm处测定其浓度，用琼脂糖凝胶电泳检测其完好程度。取纯化后质量合格的DNA作为模板进行16SrDNA的扩增，引物为27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；反应条件为：预变性 94℃，5min；变性 94℃ 30s，退火 55℃ 1min，延伸72℃ 1min，30循环，最终延伸72℃ 10min。反应体系为：2×Taq PCR Master Mix(with Blue Dye)25μL， DNA模板1μL，正反向引物各1μL ，补足无菌去离子水至50μL。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收后送上海生工(生物)进行测序，测序完成后将序列在https://www.ezbiocloud.net/数据库中进行16SrDNA相似性比较分析。

1.2.4 酶活测定

粗酶液液制备：挑取保存至斜面上的纯培养物接种至发酵培养基，37℃摇床培养48h后于4℃，6000rpm离心取上清进行酶活测定。

酶活测定[9]：采用碘比色改良法对粗酶液进行酶活测定。具体做法如下：取5mL 0.5%的可溶性淀粉溶液于40℃水浴中预热10min后加入稀释适当倍数的酶液0.5mL，反应5min后加入5mL 0.1mol/L H2SO4终止反应。取0.5 mL反应液与5mL碘液显色后于620nm处测定吸光值。用0.5mL水代替0.5mL反应液为空白，以不加酶液的反应管为对照。酶活力单位定义：40℃下，5分钟内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位。酶活力(U/mL)=(R0-R)/R0×50×D

R0：对照吸光值； R：反应液吸光值；D：酶液稀释倍数(调整D使(R0-R)/R0在0.2～0.7之间)

2 结果与分析

2.1 菌株筛选及鉴定

2.1.1 菌株形态学鉴定

初筛平板于37℃培养24～48h(根据其上单菌落长出情况)后用卢戈氏碘液染色，若菌落周围有明显水解圈，说明该菌可产生胞外淀粉酶。其中水解圈较大的菌落呈白色，中间凸起，干燥，菌落周围呈锯齿状，将该菌株命名为Y1，对其进行革兰氏染色紫色，为革兰氏阳性菌，呈长杆状，有明显芽孢，Y1菌落形态及镜检形态见图1。

图1 A为Y1在淀粉平板上产生的透明水解圈；B为镜检形态(100×)

2.1.2 PCR产物扩增电泳分析

图2 菌株Y116SrDNA PCR扩增产物电泳图 (泳道1为样品；泳道2为DL2000 Maker)

将菌株Y1的16SrDNA产物于1%的琼脂糖进行凝胶电泳分析，菌株Y1的16SrDNA产物条带单一，约1.5kb，与预期大小一致。

2.1.3 16SrDNA分子生物学鉴定

菌株Y1 16SrDNA基因序列测序所获得序列长度为1501bp，将其与https://www.ezbiocloud.net/数据库中的序列进行同源性比对，发现Y1与芽孢杆菌属的16SrDNA基因序列自然聚类，将Y1的16SrDNA基因序列与9条相似性较高的序列利用MEGA7.0按照邻接法(Neighbor-Joining )构建系统发育树见图3，从图中可看出Y1 与BacilluscereusATCC 14579 AE016877聚为一群，表明Y1与BacilluscereusATCC 14579 AE016877的亲缘关系最近，结合其形态学特征，初步鉴定Y1为蜡样芽孢杆菌。

图3 基于16SrRNA基因序列相似性的菌株Y1与9株细菌的系统进化树

2.2 Y1酶活测定

Y1菌株粗酶液的酶活为140U/mL， 与文献中其他报道的产淀粉酶蜡样芽孢杆菌相比酶活一般，可能是酶活测定的方法不同使然。目前淀粉酶测定方法主要有碘比色改良法[9]、3,5-二硝基水杨酸法[10]等，以上两种方法均可测定α-淀粉酶酶活，本研究中采用的是碘比色改良法，该方法较为简便灵敏，但测定时碘液需现配现用，且待测酶液需稀释至一定浓度，使其吸光值处于线性范围内。师永生等[11]从废弃的淀粉堆中筛选到一株产低温淀粉酶的蜡样芽孢杆菌(B.cereus)GXBC-1,从中克隆到一个淀粉酶基因并在大肠杆菌中进行重组表达,该重组酶最适温度为35℃,在20℃仍具有53%的活力;最适pH值为7.0,Km值为0.72 mg/mL。任平等[12]等从畜禽动物胃肠道中可产淀粉酶、蛋白酶的蜡样芽孢杆菌(B.cereus)J2、J14。王磊等[13]从土壤中筛选出4株产淀粉酶芽孢杆菌，其中1株为枯草芽孢杆菌，3株为蜡样芽孢杆菌，利用3,5-二硝基水杨酸比色法测定其酶活，其中地衣芽孢杆菌Bacillus3的酶活最高，为8.4U/mL。

3 讨论

土壤是微生物种类最丰富的生境之一，本研究从10个土壤样品中仅分离到一株产α-淀粉酶菌株Y1，可能是样品处理过程前未进行富集培养，也可能是培养基较为单一，而芽孢杆菌的对环境适应性耐受性强，容易筛选。目前已报道的产淀粉酶的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(B.subtilis)[14]、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)[15]、地衣芽孢杆菌(B.lincheniformis)[16]等，分离生境较为丰富，包括土壤[5,13]、海洋[17]、动物肠道[12]等；其中部分菌株除了可产胞外淀粉酶外，还可以产蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶等，可在食品、饲料、生物防治等领域进行应用。本研究中筛选到的菌株Y1为蜡样芽孢杆菌，仅对其进行了鉴定和酶活初探，在今后工作中将对其发酵条件和酶学性质进行深入研究，以期为该酶的开发应用提供理论依据。