韩星 冯星

【摘要】 目的：分離培养并鉴定新生大鼠松果体细胞，观察其体外增殖情况。方法：选择30只新生SD大鼠，处死后分离松果体组织，采用多聚赖氨酸对培养板予预包被处理胰酶消化、经差速贴壁分离等方法，对新生大鼠松果体细胞进行体外分离培养并传代。观察50 d内体外培养的松果体细胞的形态变化，培养7 d时采用免疫荧光法，观察原代松果体细胞5-羟色胺（5-HT）及微管相关蛋白-2（MAP-2），实时定量PCR法检测N-乙酰基转移酶（AANAT）及生长抑素（SS）mRNA。分别取传代第1、3、5代对数生长期细胞测定细胞增殖情况。结果：新生大鼠松果体细胞呈圆球形或多角形，培养21 d时松果体细胞体积明显增大，胞质内可见深色细小囊泡状颗粒。培养7、14、21、28 d时，随培养时间延长，松果体细胞AANAT mRNA的相对表达量逐渐降低（P<0.05），松果体细胞SS mRNA的相对表达量先升高后降低（P<0.05）。细胞传代后第1、3代细胞生长曲线近似“S”形，且第3代细胞增殖最为旺盛;随传代次数增加，第5代细胞生长曲线近似平缓，细胞逐渐衰老、死亡。结论：采用胰酶消化、差速贴壁分离等方法并结合含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，可获得纯度较高且有增殖潜力的大鼠松果体细胞，细胞在体外增殖活跃，且具有一定的生物学功能。

【关键词】 松果体细胞 五羟色胺 微管相关蛋白-2 N-乙酰基转移酶 生长抑素 细胞增殖

[Abstract] Objective： To isolate， culture and identify the pineal cells of newborn rats and observe their proliferation in vitro. Method： A total of 30 newborn SD rats were selected， the pineal tissue was separated after death， the pineal cells of newborn rats were cultured and subcultured in vitro by the methods of trypsin digestion and separation by differential attachment. The morphological changes of pineal cells cultured in vitro within 50 days were observed， after 7 days of culture， 5-hydroxytryptamine （5-HT） and microtubule associated protein-2 （MAP-2） were observed by immunofluorescence， the mRNA of N-acetyltransferase （AANAT） and somatostatin （SS） were detected by real-time quantitative PCR. The first， third and fifth generations of logarithmic growth cells were collected and the cell proliferation was measured. Result： The pineal cells of the newborn rats were round or polygonal， after 21 days of culture， the volume of pineal cells increased significantly， and dark vesicular granules were seen in the cytoplasm. At the 7th， 14th， 21st and 28th day of culture， with the prolongation of culture time， the relative expression of AANAT mRNA decreased gradually （P<0.05）， and the relative expression of SS mRNA increased first and then decreased （P<0.05）. The growth curve of the first and third generation cells was similar to “S” shape， and the third generation cells had the most vigorous proliferation， with the increase of subculture times， the growth curve of the fifth generation of cells was almost smooth， and the cells gradually aged and died. Conclusion： By using trypsin digestion， differential attachment separation and DMEM/F12 medium containing 10% fetal bovine serum， rat pineal cells with high purity and potential for proliferation can be obtained. The cells proliferate actively in vitro and have certain biological functions.

[Key words] Pineal gland cells 5-HT MAP-2 AANAT SS Cell multiplication

First-authors address： Childrens Hospital of Soochow University， Suzhou 215000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.36.007

松果体是哺乳动物的主要神经内分泌器官，可作为中枢昼夜节律振荡器的同时合成吲哚类和多肽类激素。褪黑素（MT）是松果体的主要分泌物，对许多器官功能具有高度的整合调节作用;5-羟色胺（5-HT）是松果体细胞合成MT的中间产物，N-乙酰基转移酶（AANAT）是一种MT限速酶，可抑制松果体细胞表达MT。微管相关蛋白-2（MAP-2）是神经元细胞骨架结构蛋白，主要存在于神经元胞体和树突。生长抑素（SS）是一种神经调节物质。既往研究曾采用哺乳类动物、鸟、鱼类的松果体器官、组织来研究松果体的形态和功能[1-4]。细胞培养技术是目前的研究热点[5-6]。建立一种简单、快速、有效的松果体细胞培养方法，获得高存活率及高生物活性的松果体细胞仍是目前细胞培养的关键。笔者采用相关方法对新生大鼠松果体细胞进行体外分离培养，并作鉴定。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料选择 出生时间<24 h的正常清洁级SD大鼠30只，雌雄不限，体重5～6 g，所有实验动物均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。DMEM/F12培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、链霉素以及青霉素均由美国Gibco公司所提供;美国Sigma公司提供多聚赖氨酸、胰蛋白酶以及阿糖胞苷;CCK-8购自上海东仁化学科技有限公司;PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 大鼠松果体细胞体外分离培养鉴定方法

1.2.1 取材 30只健康的新生SD大鼠均实行颈椎脱臼法将其处死，随后利用75%乙醇进行彻底消毒，并将大鼠全部固定在实验操作板上，确保整个操作过程处于无菌环境下，经其颅骨骨片向前掀开，游离粘连于颅骨上的松果体，利用显微手术镊剥除血管以及外膜，随后将其放置在冷PBS加DMEM高糖培养基等体积混合液的EP管中留以备用。

1.2.2 胰酶消化分离培养 根据情况提取适量的松果体组织，随后实行冷PBS洗涤，并加入剂量为1 mL的0.25%胰蛋白酶，随后将其放置温度为37 ℃的保温箱中进行消化，消化时间控制为20 min，并轻吹1 min，将细胞吹散。随后将液体转至剂量为15 mL的离心管内，并用相同体积的FBS以此來终止消化，经1 000 r/min离心处理，弃上清，加入8 mL含10%的FBS、1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基进行轻轻吹打，重悬细胞，严格按照按5×105/mL的细胞密度比例接种于多聚赖氨酸包被过夜的6孔培养板，让其处于静置状态，并培养于体积分数5% CO2，温度37 ℃的培养箱内进行培养。

1.2.3 松果体原代细胞分离纯化及传代培养 按照松果体细胞贴壁与神经胶质细胞时间不同的原理分别实行差速分离。提取并培养1周的分离细胞生长至90%培养板的时候，利用PBS反复清洗2次，随后采用0.25%胰蛋白酶加以消化。随后在显微镜的指引下对消化情况进行观察，倘若细胞由紧密贴壁的形态渐渐转改变为圆形悬浮状态，则予等体积FBS终止消化，随后抽取细胞悬液15 mL，实行离心以后再弃上清，将细胞悬液进行重新调配，随后将其放置于专门的培养箱中，将培养时间控制为15 min，吸取未贴壁的细胞悬液重新接种于25 mL培养瓶，经过12 h的培养，加入阿糖胞苷2.5 μg/mL，随后培养2 d后将溶液重新换掉。培养7 d后观察细胞生长至培养瓶的90%左右以后，按照1︰3比例进行传代培养，第2天再将半量更换培养基，随后按照规定的时间进行观察。

1.2.4 大鼠松果体细胞鉴定 间隔1 d后利用倒置显微镜来查看体外松果体细胞整体的变化情况。随后抽取经过培养1周的原代松果体细胞，严格按照免疫荧光法进行5-HT、MAP-2鉴定。利用室温PBS反复轻轻漂洗3次，5 min/次，再经室温4%多聚甲醛中固定0.5 h，控制室温让其晾干，PBS反复清洗3次，10 min/次，0.1% Triton-100浸润10 min，PBS反复清洗3次，10 min/次，随后在每个孔注入剂量为200 μL的FBS，将其在室温封闭至少1 h，随后弃去血清，并将1︰100的兔抗鼠5-HT（Ⅰ抗）200 μL将入其中，放置于温度为4 ℃的室内过夜，PBS反复清洗3次，10 min/次;最后将1︰500 FITC标记的羊抗兔IgG（Ⅱ抗）200 μL加入其中，放置于背光的室温内进行1 h的孵育，PBS反复清洗3次，5 min/次;随后进行DAPI染核（1︰2 000），放置于背光的室温内进行2 min的孵育;最后做同型对照，不加Ⅰ抗，余步骤同前，甘油封片，荧光显微镜下观察松果体细胞5-HT、MAP-2。分别取培养7、14、21、28 d的松果体细胞，TRIzol法提取总RNA，逆转录生成cRNA，采用实时定量PCR法测定大鼠松果体细胞中AANAT及SS mRNA。以GADPH为内参，根据GenBank中调取的大鼠AANAT、SS和GADPH完整cDNA序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计PCR引物，PCR引物序列见表1。反应体系：cDNA 2 μL，SYBR Green PCR minasterMix 20 μL，AANAT、SS和GAPDH上下游引物各1 μL，反应总体积20 μL。反应条件：95 ℃预热、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s，72 ℃收集荧光，共45个循环。运用LightCyler 480软件进行实时数据收集和定量分析，采用公式2-ΔΔCt法计算各样本中AANAT及SS mRNA的相对表达量。

1.3 大鼠松果体细胞体外增殖情况观察 根据CCK8法，将传代第1、3、5代对数生长期细胞分别取出，随后分别以1×105/孔的细胞密度接种在的96孔板内，每代为21个复孔。在每个孔内均注入剂量为100 μL的细胞培养液，随后将其放置于温度为37 ℃、5% CO2细胞培养箱中加以培养。加入10 μL CCK-8溶液后于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养2 h。以只加入细胞培养液不加入细胞的空白孔为平行对照孔，最后比色时，以空白孔调零。用酶标仪测定不同时间点传代第1、3、5代松果体细胞450 nm波长处的吸光度值（A450），3孔/d，连续测7 d。以培养时间（d）为横坐标，A450值为纵坐标绘制传代第1、3、5代松果体细胞的生长曲线。

1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠松果体细胞形态 原代松果体细胞主要以悬浮状态，而外形则以圆球形为主，当实行接种以后的15 min便会贴壁，绝大部分的细胞在经过1 d的培养后便会完成贴壁，发生贴壁后细胞主要以多角形或者是圆球形呈现，贴附于成纤维细胞层上方并且保持散在形势不断生长，在培养的整个流程中会伴随着细胞的分裂而不断地聚集生长。当培养21 d以后，其松果体细胞的体积会发生显著增大，并且能够在胞浆内观察到深色的细小囊泡状颗粒，后期生长极为旺盛，不断分裂且活跃。经过50 d的培养，松果体细胞便不会再增殖，细胞则会呈现脱落以及死亡状态，仅仅能够成胶质细胞或者是纤维细胞才能存活。

2.2 不同时间点大鼠松果体细胞AANAT及SS mRNA的相对表达量比较 培养7、14、21、28 d时，随培养时间延长，松果体细胞AANAT mRNA的相对表达量逐渐降低（P<0.05），松果体细胞SS mRNA的相对表达量先升高后降低（P<0.05）。见表2。

2.3 大鼠松果体细胞体外增殖情况 第1、3代细胞生长曲线近似“S”形，第1、3代细胞接种2～3 d后，细胞数量增多，第3、4天为对数生长期，5 d后细胞数平稳无明显增加;第5代细胞接种后生长曲线近似平缓，A450值无明显变化，细胞数增加不明显，无明显对数生长期。见表3、图1。

3 讨论

松果体细胞体外培养可以去除体液因素以及神经对松果体的作用，可作为研究其自身分泌功能、特性以及合成重要方法。然而在对细胞进行培养的整个过程中会面临细胞不易传代、不纯以及生长缓慢等一系列问题，所以，采用成功以及简便的方式来获得纯度高且极为稳定的松果体细胞至关重要。

本研究使用新生大鼠松果体作为细胞培养的组织来源[7]，因新生大鼠松果体常粘于颅顶骨，易于剥离，不易污染，且组织较软，游离后易消化、离心等。培养过程中还发现使用出生24 h内新生大鼠松果体较生后10 d大鼠松果體培养效果好，考虑与新生大鼠松果体细胞较好的增殖及分化潜能有关。游离松果体后剥离外膜及血管，利于得到较纯的松果体细胞，且将游离松果体置于装有DMEM高糖的培养基中利于消化、分离后细胞的存活;松果体组织本身质地较软，易于消化，胰酶消化时间不宜过长，吹打轻柔均可减少细胞在操作过程中的损伤;此外，本研究所采用的多聚赖氨酸对培养板进行预包被，具有一定促进松果体贴壁的重要价值作用，可显著缩短松果体细胞贴壁的整体时间，让细胞能够继续生长。当松果体细胞处于含10% FBS的DMEM/F12培养基中的时候，能够促使其良好的增殖下去[8-9]，当培养7 d左右，可按照阿糖胞苷以及差速贴壁的方法对胶质细胞的生长起到一定的抑制作用，以此来确保纯化松果体细胞同时传代培养，同时注意阿糖胞苷浓度不易过高，否则会抑制松果体细胞的生长[10]。以上方法可以为松果体细胞体外培养创造适宜的环境，为进一步探讨其生物学功能的研究提供了实验基础。针对松果体细胞的增殖能力进行研究，能够对生长特征有一个深度的认识。本实验使用CCK-8测量细胞相对的A450值绘制细胞生长曲线，能够清晰地反映出细胞的增殖状况，其中第1、3代细胞生长曲线近似“S”形，可见其增殖的状况较好，针对松果体细胞体外可以进行传代培养，而第5代细胞接种后生长曲线近似平缓，吸光度无明显变化，细胞数增加不明显，无明显对数生长期。所以松果体细胞在体外培养传代的次数有一定限制的，同时传代3代内的细胞更适合实验。

在体外培养条件下可以分化为多种类型的细胞，包括几种类型的光感受细胞，如5-HT能神经元，HPC-1阳性的神经元等，根据体外培养后多种分化潜能可用多种方法进行鉴定[8]，S-antigen是位于松果体细胞内的光感受特殊蛋白，对松果体细胞也有较好的鉴别效果，GABA、神经特殊抗原（HPC-1）以及MAP-2等一系列抗体联同突触膜蛋白经过免疫组化已定位在培养的大鼠松果体细胞[8-10]，均能够证明神经化学的特征。本实验通过利用免疫荧光染色对5-HT进行鉴定，由于5-HT属于褪黑素构成的一种中间产物，既可鉴定，同时还能对松果体细胞的功能进行初步判断;利用MAP-2做免疫荧光鉴定，表明体外培养的松果体细胞不仅仅拥有内分泌功能，并且存在神经元特性[11-12]。

AANAT为褪黑素合成的限速酶，在体内由松果体内的交感神经终末释放去甲肾上腺素及肾上腺素，使松果体细胞内的AANAT活性增加，最终导致MT生成增加[13]。AANAT作为神经内分泌传感器分子在合成及调节褪黑素方面非常特殊及重要[14]。体外培养的松果体细胞的AANAT表达水平可以间接反映细胞MT的分泌水平。本研究体外培养的松果体细胞在培养第1周AANAT mRNA表达水平较高，随培养时间的延长，AANAT mRNA表达水平逐渐减低（P<0.05），考虑原因为松果体细胞脱离机体，缺少了交感神经终末释放的去甲肾上腺素的调节作用，AANAT的表达水平逐渐降低[15-16]。松果体除分泌MT等胺类激素外，还分泌多种肽类物质，如SS等。SS是一种神经调节多肽，在神经内分泌平衡中起复杂的调节作用，并与学习记忆活动有关[17]，主要分布在中枢神经系统和消化系统中，其他如内分泌系统的松果体等也有分布[18]。文献[19]采用RT-PCR技术检测到大鼠松果体培养细胞表达SS mRNA，并推测这种多肽以旁分泌的作用形式调节松果体细胞的特征形成。本研究发现体外培养的大鼠松果体细胞可表达SS mRNA，且于培养第3周表达量最高，与松果体细胞自身增殖的水平高低一致，考虑SS的确以旁分泌的方式来调节自身细胞的生长。

综上所述，本研究以多聚赖氨酸对培养皿预包被，胰酶消化、差速贴壁分离、阿糖胞苷抑制胶原细胞生长等方法可获得纯度较高的大鼠松果体细胞，通过生长曲线的测定证明了其可体外传代培养，但传代次数有限，5-HT及MAP-2可较好的鉴别松果体细胞，且体外培养的细胞具有一定的生物学功能，可以作为有用的体外模型来进一步研究生物节律及内分泌系统。

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（收稿日期：2019-09-24） （本文编辑：董悦）