史伟国，白国栋，宗希明，袁 寰，杜 鹃，高庆东

(1.佳木斯大学 药学院，黑龙江 佳木斯 154007;2.佳木斯市中医医院，黑龙江 佳木斯 154002)

脱皮马勃(LasiosphaerafenzliiReich.)，为灰包科脱皮马勃属真菌的干燥子实体。被收载于《中国药典》(2015版第一部)。其性味辛平，归肺经。外用治鼻衄，创伤出血[1]。马勃所含的重要活性成分多糖，因其具有保护肝脏损伤[2]、清除超氧离子自由基[3]等作用，在近几年越来越被重视。这种真菌类多糖的获取途径有很多种，可以通过对真菌干燥的子实体的水提取获得[4]，也可以通过菌丝体和发酵液的代谢产物获得[5]，还可以在酶的辅助下提取获得[6]。本项研究是在一定功率的超声波辅助下，水料比、提取时间和提取温度对马勃粗多糖提取率的影响，应用星点设计-响应面试验设计法，优化超声波辅助提取马勃的条件，以期能为马勃多糖的提取和进一步研究提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马勃药材购于黑龙江省佳木斯市百草堂药店，经佳木斯市中医医院制剂室主任中药师丁丽鉴定为脱皮马勃(LasiosphaerafenzliiReich.)，粉碎过筛，作为样品。葡萄糖、浓硫酸、苯酚、乙醇均为国产分析纯试剂，水为蒸馏水。

1.2 仪器

KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(岛津公司)，AUW220D型电子分析天平(岛津公司)，SF-200B型高速粉碎机(上海中药机械厂)，HH-24型恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)，202系列电热恒温干燥箱(上海叶拓仪器仪表有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 提取马勃粗多糖

称取经粉碎后过3号筛马勃粉末5.0 g，用87%乙醇50 mL浸泡过夜，抽滤，滤渣用87%乙醇洗脱2次。室温放置，待乙醇自然挥发后残渣在超声功率为200 W的条件下，按一定液料比、提取温度、提取时间进行提取。抽滤，离心。用苯酚-硫酸法[7]，测定吸光度，计算马勃粗多糖的提取率。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的制备

精密称取干燥至恒重葡萄糖粉末10 mg，定容至100 mL，待葡萄糖完全溶解,得0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。精密称取葡萄糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL分别置于试管中，分别加水2、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL，加5%苯酚溶液1.0 mL，振匀，快速加入浓硫酸5.0 mL，放置10 min，振匀，置100 ℃水浴15 min后，取出室温放凉，测定吸光度，在490 nm波长处出现最高值，以葡萄糖的浓度(C)为横坐标，吸光度(A490)为纵坐标绘制曲线。

1.3.3 马勃粗多糖的测定

精密吸取按“1.3.1”项下方法提取后，稀释至合适浓度的样品溶液2 mL，按照苯酚-硫酸法测定马勃粗多糖吸光度。根据样品吸光度计算多糖提取率。

1.3.4 单因素试验设计

在超声功率固定为200 W的条件下，以提取温度40 ℃，提取时间40 min，液料比为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL·g-1，分别提取粗多糖，测提取率；以提取温度40 ℃，液料比为25∶1 g·mL-1，提取时间为30、40、50、60、70 min，分别提取粗多糖，测提取率；以提取时间为50 min，液料比为25∶1 g·mL-1时，提取温度30、40、50、60、70 ℃，分别提取多糖，测定多糖提取率。确定最佳提取条件。

1.3.5 星点设计-响应面试验设计

以液料比(X1)、提取时间(X2)和提取温度(X3)3个因素分别选取5个水平对马勃粗多糖提取率(Y)进行考察，设计星点试验。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

按“1.3.2”项下操作，得回归方程A490=50.96C+0.015 3R2=0.999 1

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 提取率计算公式

马勃粗多糖提取率(%)=

[(A490-0.0153)/50.96×稀释倍数×样品溶液体积]/样品质量

式中：A490为马勃样品的吸光度。

2.3 单因素试验结果与分析

2.3.1 液料比对提取率的影响

由图2可知，马勃粗多糖的提取率在最开始的时候是随料液比的增加而大幅度增大，差异性显著，但到达25∶1后继续增大料液比，多糖的提取率还会增高，但增高的幅度变小，差异性不显著，故选料液比25∶1为最佳液料比。

2.3.2 提取时间对提取率的影响

由图3可知，马勃粗多糖的提取率在最开始是逐渐上升，后小幅度下降，分析原因可能是在超声波的空化和机械剪切力的作用下使细胞迅速破裂，促进胞内粗多糖的渗出。但超声提取时间过长，也会裂解多糖的结构，导致先升后降的结果。在50 min时，多糖提取率达到最高，故选50 min为最佳提取时间。

2.3.3 提取温度对提取率的影响

由图4可知，马勃粗多糖的提取率是随着温度的升高而显著增大，后小幅度下降，分析原因可能是粗多糖在溶剂中的溶解度随着温度的升高而增大，后当达到一定温度后，由于高温可能对多糖的结构产生影响，导致先升后降的结果。在提取温度为50 ℃时多糖的提取率最高，故选50 ℃为最佳提取温度。

图2 液料比对粗多糖提取率的影响

图3 提取时间对粗多糖提取率的影响

图4 提取温度对粗多糖提取率的影响

2.4 星点设计-响应面试验设计

根据Central Composite Design设计原理，通过对单因素试验结果的分析，星点设计因素水平见表1。

表1 马勃粗多糖提取工艺星点设计因素表

2.5 星点设计-响应面试验结果与分析

响应值(Y)代表多糖提取率，分别对各因素(X1、X2、X3)进行二项式方程拟合，见表2。

2项式方程拟合模型：Y=3.49+0.42X1+0.21X2+0.16X3-0.12X1X2+0.086X1X3+0.073

X2X3-0.10X2 1-0.28X2 2-0.24X2 3(R2=0.9803)。

由回归分析结果(表3)可知，二项式方程拟合模型P<0.000 1，达到高度显著水平，模型可以通过检验，R2=0.980 3，失拟为P>0.05(不显著)，说明该方程的预测值比较接近实际值，具有较高的可信度。该实验的显著影响因素为：X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2 1、X2 2、X2 3。将不显著因素删除，方程简化为：

Y=3.49+0.42X1+0.21X2+0.16X3-0.12X1X2+0.086X1X3-0.10X2 1-0.28X2 2-0.24X2 3

(R2=0.972 8)

表3 马勃粗多糖提取工艺回归分析结果

2.6 工艺参数的预测与优化

使用Design-Expert 8.0.6软件，对已得二项式拟合方程绘制3D响应面，见图5～7。

图5 液料比与时间对多糖得率的影响3D图

图6 液料比与温度对多糖得率的影响3D图

图7 时间与温度对多糖得率的影响3D图

根据二项式模型的预测，马勃粗多糖最佳提取工艺为：液料比30∶1( mL∶g),提取时间53.77 min，提取温度58.33 ℃，多糖提取率为3.88%。根据上述工艺，采用液料比30 mL·g-1、提取时间54 min、提取温度58 ℃，平行验证3次，粗多糖的平均提取率为4.01%，验证的结果与模型预测值相近，因此，该方法可以考虑作为超声波辅助提取马勃粗多糖的优化与预测。

3 小 结

本试验运用3因素5水平星点设计-响应面法研究了马勃粗多糖的提取率在固定超声功率的情况下，和液料比、提取时间、提取温度这三个因素之间的关系，并且预测出最佳提取工艺参数：液料比30∶1( mL∶g),提取时间53.77 min，提取温度58.33 ℃。根据试验所得最佳工艺进行验证后，实测平均提取率为4.01%。说明使用该方法来确定马勃粗多糖的最佳提取工艺预测性较好，可以为马勃的开发利用奠定基础，提供基础数据。