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预知子化学成分的分离与鉴定

2019-01-15金洪光刘可越曲伟红李同建余敬谋

天然产物研究与开发 2019年12期
关键词:木通三萜类奎宁

金洪光,刘可越,曲伟红,李同建,廖 亮,余敬谋

九江学院药学与生命科学学院,九江 32000

预知子为木通科植物木通Akebiaquinata(Thunb.) Decne.、三叶木通Akebiatrifoliate(Thunb.) Koidz.[ClematistrifoliateThunb.]或白木通Akebiatrifoliate(Thunb.) Koidz.var.australis(Diels) Rehd.的干燥近成熟果实。性苦、寒。归肝、胆、胃、膀胱经。具有疏肝理气,活血止痛,散结,利尿的功能,用于脘胁胀痛,痛经经闭,痰核痞块,小便不利[1]。预知子属于药食两用植物,鲜果味道甘甜,含有多种营养成分[2]。Zhong[3]对三叶木通的果实进行了测定,其中含有多种人体必需的氨基酸,有较高的营养价值。现代药理学研究表明,预知子提取物具有保肝、抗抑郁、抗癌、抗炎等作用[4]。本课题组前期研究发现,预知子提取物对四氯化碳致小鼠肝损伤具有保护作用[5]。同时,预知子提取物联合熊去氧胆酸对非酒精性脂肪肝病具有治疗作用[6]。木通属植物特征性化学成分为三萜类成分。目前,非三萜类成分也不断被发现。课题组前期从木通藤茎中分得多个非三萜类化合物[7],Jiang[8]从预知子95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分离鉴定了多个非三萜类化合物。为了进一步揭示预知子中的化学成分,对预知子甲醇提取物进行了系统研究,从乙酸乙酯部位和正丁醇部位分离鉴定了14个非三萜类化合物,化合物5~10、12~14为首次从预知子中分离得到。

1 仪器与材料

JEOL JNM ECP- 400核磁共振仪(日本东京公司);Q- TOF micro LC- MS/MS 质谱仪(美国Waters 公司);YL 9100 HPLC系统(韩国英麟公司)。薄层色谱硅胶GF254正相板、RP- 18反相板(德国默克公司);常规柱色谱硅胶Kieselgel 60,70 ~ 230、230 ~ 400 目;反相柱色谱YMC- C18(德国默克公司);Sephadex LH- 20、大孔吸附树脂HP- 20(日本三菱化学公司);所有分离用试剂均为国产分析纯。

预知子于2017年9月采摘自九江学院木通园,经九江学院廖亮教授鉴定为Akebiaquinata(Thunb.)Decne.的果实,现保存于九江学院药学与生命科学学院。

2 提取与分离

预知子粗粉2.00 kg,甲醇回流提取3 h,共3次,合并提取液,浓缩后得总浸膏。总浸膏加适量蒸馏水分散后,依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取。回收溶剂,得正己烷萃取物(22.5 g)、乙酸乙酯萃取物(56.8 g)、正丁醇萃取物(67.2 g)。

取乙酸乙酯萃取物50.0 g,经Sephadex LH- 20柱色谱分离,以氯仿- 甲醇(1∶1)洗脱,得到Fr.E.1 ~ Fr.E.5共5个组分。组分Fr.E.2经硅胶柱色谱分离,以氯仿- 甲醇(10∶1→5∶1)梯度洗脱,得到Fr.E.2.1 ~ Fr.E.2.6共6个组分。组分Fr.E.2.3经ODS色谱柱分离,以甲醇- 水(1∶3→1∶1)洗脱得到化合物1(8.6 mg)。组分Fr.E.4经硅胶柱色谱分离,以正己烷- 乙酸乙酯(15∶1→1∶1)梯度洗脱,得到Fr.E.4.1 ~ Fr.E.4.8共8个组分。其中Fr.E.4.4经硅胶柱色谱分离,以正己烷- 乙酸乙酯(10∶1→5∶1)洗脱得到化合物2(3.4 mg)和化合物3(6.4 mg)。组分Fr.E.4.6经ODS色谱柱分离,以甲醇- 水(1∶5→1∶3)洗脱得到化合物4(16.7 mg)和化合物5(6.3 mg)。组分Fr.E.5经Sephadex LH- 20柱色谱分离,以氯仿- 甲醇(4∶1)洗脱得到Fr.E.5.1 ~ Fr.E.5.6共6个组分。组分Fr.E.5.3经制备型HPLC(甲醇- 水,60%→80%)分离纯化得到化合物6(5.1 mg)和化合物7(3.6 mg)。

取正丁醇萃取物65.2 g,经大孔吸附树脂HP- 20柱色谱分离,依次用蒸馏水及20%、40%、60%、80%和100%甲醇梯度洗脱,得到Fr.B.1 ~ Fr.B.6共6个组分。组分Fr.B.2经Sephadex LH- 20柱色谱分离,以甲醇- 水(1∶1)洗脱,得到Fr.B.2.1 ~ Fr.B.2.7共7个组分。其中,Fr.B.2.3经硅胶柱色谱分离,以氯仿- 甲醇- 水(5∶1∶0.2→1∶1∶0.2)梯度洗脱,得到化合物8(2.1 mg)和9(4.8 mg);组分Fr.B.2.4经ODS柱色谱分离,以甲醇- 水(1∶4→1∶1)分离得到Fr.B.2.4.1 ~ Fr.B.2.4.5共5个组分,组分Fr.B.2.4.2经制备型HPLC(甲醇- 水,35%→55%(0.1%甲酸))分离纯化得到化合物10(3.6 mg)和11(6.2 mg)。组分Fr.B.3经硅胶柱色谱分离,以氯仿- 甲醇- 水(3∶1∶0.1→1∶1∶0.1)分离得到Fr.B.3.1 ~ Fr.B.3.6共6个组分,组分Fr.B.3.2经ODS柱色谱分离,以甲醇- 水(1∶3→1∶1)洗脱,得到化合物12(2.2 mg)、13(5.3 mg)和14(4.8 mg)。

3 结构鉴定

化合物1无色针状结晶;EI- MS:m/z138 [M]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.02(2H,dd,J=2.4,8.4 Hz,H- 2′,6′),6.79(2H,dd,J=2.4,8.4 Hz,H- 3′,5′),3.67(2H,t,J=7.6 Hz,H- 1),2.70(2H,t,J=7.6 Hz,H- 2);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:155.4(C- 4′),129.7(C- 1′),129.5(C- 2′,6′),114.8(C- 3′,5′),63.3(C- 1),38.1(C- 2)。以上数据与文献[9]报道的基本一致,由此确定化合物1为酪醇。

化合物2无色粉末;ESI- MS:m/z203 [M + Na]+;1H NMR(C5D5N,400 MHz)δ:7.58(1H,d,J=16.0 Hz,H- 7),7.17(1H,d,J=2.0 Hz,H- 2),7.00(1H,dd,J=2.0,8.4 Hz,H- 6),6.88(1H,d,J=8.4 Hz,H- 5),6.33(1H,d,J=16.0 Hz,H- 8);13C NMR(C5D5N,100 MHz)δ:166.9(C- 9),149.1(C- 4),146.4(C- 3),145.3(C- 7),126.3(C- 1),121.8(C- 6),116.4(C- 5),115.3(C- 8),115.2(C- 2)。以上数据与文献[10]报道的基本一致,由此确定化合物2为咖啡酸。

化合物3白色结晶;ESI- MS:m/z177 [M + Na]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.42(1H,d,J=2.0 Hz,H- 2),7.39(1H,dd,J=2.0,8.0 Hz,H- 6),6.78(1H,d,J=8.0 Hz,H- 5);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:169.4(C- 7),149.9(C- 4),144.6(C- 3),122.6(C- 6),122.4(C- 1),116.4(C- 2),114.4(C- 5)。以上数据与文献[11]报道的基本一致,由此确定化合物3为原儿茶酸。

化合物4白色结晶;ESI- MS:m/z161 [M + Na]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.86(2H,d,J=8.8 Hz,H- 2,6),6.80(2H,d,J=8.8 Hz,H- 3,5);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:168.94(C- 7),161.9(C- 4),131.6(C- 2,6),121.8(C- 1),114.6(C- 3,5)。以上数据与文献[12]报道的基本一致,由此确定化合物4为对羟基苯甲酸。

化合物5白色结晶;ESI- MS:m/z217 [M + Na]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.60(1H,d,J=16.0 Hz,H- 7),7.17(1H,d,J=2.0 Hz,H- 2),7.06(1H,dd,J=2.0,8.4 Hz,H- 6),6.80(1H,d,J=8.4 Hz,H- 5),6.32(1H,d,J=16.0 Hz,H- 8),3.88(3H,s,- OCH3);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:169.8(C- 9),159.2(C- 4),148.0(C- 3),145.5(C- 7),126.5(C- 1),122.6(C- 6),115.1(C- 8),114.8(C- 5),110.4(C- 2),55.1(- OCH3)。以上数据与文献[13]报道的基本一致,由此确定化合物5为阿魏酸。

化合物6类白色粉末;ESI- MS:m/z323 [M + Na]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.06(2H,d,J=8.4 Hz,H- 2,6),6.68(2H,d,J=8.4 Hz,H- 3,5),4.29(1H,d,J=7.6 Hz,H- 1′),4.03(1H,dd,J=1.6,8.0 Hz,H- 8),3.86(1H,dd,J=2.4,12.0 Hz,H- 6′),3.70(1H,dd,J=1.6,8.0 Hz,H- 8),3.66(1H,dd,J=5.6,12.0 Hz,H- 6′),3.35(1H,dd,J=7.6,9.0 Hz,H- 3′),3.23- 3.32(2H,m,H- 4′,5′),3.18(1H,dd,J=8.0,9.2 Hz,H- 2′),2.83(2H,dt,J=2.0,7.6 Hz,H- 7);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:157.0(C- 4),131.1(C- 2,6),130.9(C- 1),116.2(C- 3,5),104.5(C- 1′),78.2(C- 5′),78.1(C- 3′),75.3(C- 2′),72.2(C- 8),71.8(C- 4′),62.9(C- 6′),36.5(C- 7)。以上数据与文献[14]报道的基本一致,由此确定化合物6为红景天苷。

化合物7类白色粉末;FAB- MS:m/z317 [M + H]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:6.68(1H,d,J=2.0 Hz,H- 2),6.66(1H,d,J=8.0 Hz,H- 5),6.55(1H,dd,J=2.0,8.0 Hz,H- 6),4.28(1H,d,J=7.6 Hz,H- 1′),4.02(1H,dd,J=3.6,8.0 Hz,H- 8),3.86(1H,dd,J=2.0,12.0 Hz,H- 6′),3.70(1H,dd,J=7.6,8.0 Hz,H- 8),3.66(1H,dd,J=5.6,12.0 Hz,H- 6′),3.34(1H,dd,J=7.6,10.0 Hz,H- 3′),3.23- 3.32(2H,m,H- 4′,5′),3.18(1H,dd,J=8.0,9.2 Hz,H- 2′),2.78(2H,dt,J=3.6,8.0 Hz,H- 7);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:146.3(C- 3),144.8(C- 4),131.6(C- 1),121.4(C- 6),117.2(C- 5),116.4(C- 2),104.5(C- 1′),78.2(C- 5′),78.1(C- 3′),75.3(C- 2′),72.2(C- 8),71.8(C- 4′),62.9(C- 6′),36.7(C- 7)。以上数据与文献[15]报道的基本一致,由此确定化合物7为羟基酪醇葡萄糖苷。

化合物8白色粉末;ESI- MS:m/z365 [M + Na]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.10(1H,d,J=8.4 Hz,H- 5),7.05(1H,d,J=1.6 Hz,H- 2),6.95(1H,dd,J=1.6,8.4 Hz,H- 6),6.55(1H,d,J=16.0 Hz,H- 7),6.30(1H,dt,J=16.0,5.6 Hz,H- 8),4.89(1H,d,J=7.2 Hz,H- 1′),4.21(2H,d,J=5.2 Hz,H- 9),3.86(3H,s,- OCH3),3.84(1H,m,H- 6a′),3.71(1H,dd,J=5.2,12.0 Hz,H- 6b′),3.50(2H,m,H- 4′,5′),3.41(2H,m,H- 2′,3′);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:149.6(C- 3),146.3(C- 4),132.3(C- 1),130.7(C- 7),127.6(C- 8),119.4(C- 6),116.6(C- 5),110.0(C- 2),101.4(C- 1′),76.9(C- 5′),76.5(C- 3′),73.6(C- 2′),70.0(C- 4′),62.4(C- 9),61.2(C- 6′),55.4(- OCH3)。以上数据与文献[16]报道的基本一致,由此确定化合物8为反式松柏苷。

化合物9白色结晶;ESI- MS:m/z395 [M + Na]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:6.76(2H,s,H- 2,6),6.55(1H,d,J=16.0 Hz,H- 7),6.33(1H,dt,J=5.5,16.0 Hz,H- 8),4.86(1H,d,J=7.5 Hz,H- 1′),4.22(2H,d,J=5.5 Hz,H- 9),3.86(6H,s,3,5- OCH3),3.78(1H,dd,J=2.0,12.0 Hz,H- 6′),3.66(1H,dd,J=5.5,12.0 Hz,H- 6′),3.21- 3.47(4H,m,H- 2′,3′,4′,5′);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:154.5(C- 3),154.5(C- 5),135.9(C- 4),135.4(C- 1),131.4(C- 7),130.2(C- 8),105.5(C- 2),105.5(C- 6),105.4(C- 1′),78.5(C- 3′),77.9(C- 5′),75.8(C- 2′),71.4(C- 4′),63.7(C- 9),62.7(C- 6′),57.1(3- OCH3),57.1(5- OCH3)。以上数据与文献[16]报道的基本一致,由此确定化合物9为紫丁香苷。

化合物10淡黄色粉末;ESI- MS:m/z501 [M + Na]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.56(1H,d,J=16.0 Hz,H- 7′′),7.03(1H,d,J=2.0 Hz,H- 2′′),6.98(1H,dd,J=2.0,8.0 Hz,H- 6′′),6.77(1H,d,J=8.0 Hz,H- 5′′),6.67(1H,d,J=2.0 Hz,H- 2),6.63(1H,d,J=8.0 Hz,H- 5),6.53(1H,dd,J=2.0,8.0 Hz,H- 6),6.28(1H,d,J=16.0 Hz,H- 8′′),4.50(1H,dd,J=2.0,12.0 Hz,H- 6′),4.33(1H,d,J=7.6 Hz,H- 1′),4.32(1H,dd,J=6.0,12.0 Hz,H- 6′),3.96(1H,m,H- 8),3.70(1H,m,H- 8),3.51(1H,m,H- 5′),3.34~3.40(2H,m,H- 3′,4′),3.22(1H,m,H- 2′),2.78(2H,dt,J=2.0,7.6 Hz,H- 7);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:169.3(C- 9′′),148.8(C- 4′′),147.4(C- 3′′),146.9(C- 7′′),146.3(C- 3),144.8(C- 4),131.5(C- 1),127.8(C- 1′′),123.3(C- 6′′),121.4(C- 6),117.2(C- 2),116.6(C- 5′′),116.5(C- 5),115.1(C- 2′′),114.8(C- 8′′),104.7(C- 1′),78.0(C- 3′),75.6(C- 5′),75.2(C- 2′),72.6(C- 8),71.8(C- 4′),64.8(C- 6′),36.8(C- 7)。以上数据与文献[17]报道的基本一致,由此确定化合物10为木通苯乙醇苷B。

化合物11类白色粉末;FAB- MS:m/z355 [M + H]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.55(1H,d,J=16.0 Hz,H- 7′),7.03(1H,d,J=1.6 Hz,H- 2′),6.94(1H,dd,J=1.6,8.0 Hz,H- 6′),6.76(1H,d,J=8.0 Hz,H- 5′),6.26(1H,d,J=16.0 Hz,H- 8′),5.33(1H,m,H- 3),4.16(1H,m,H- 5),3.70(1H,dd,J=2.8,8.4 Hz,H- 4),2.19(2H,dd,J=2.8,12.4 Hz,H- 2a,6b),2.05(2H,m,H- 2b,6a);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:181.1(C- 7),167.4(C- 9′),148.2(C- 4′),145.7(C- 7′),145.5(C- 3′),126.5(C- 1′),121.6(C- 6′),115.2(C- 5′),114.0(C- 2′),113.9(C- 8′),73.6(C- 1),72.5(C- 4),70.9(C- 5),70.5(C- 3),37.9(C- 2),36.9(C- 6)。以上数据与文献[18]报道的基本一致,由此确定化合物11为3- 咖啡酰基奎宁酸。

化合物12白色粉末;FAB- MS:m/z355 [M + H]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.62(1H,d,J=16.0 Hz,H- 7′),7.06(1H,d,J=1.6 Hz,H- 2′),6.95(1H,dd,J=1.6,8.0 Hz,H- 6′),6.77(1H,d,J=8.4 Hz,H- 5′),6.35(1H,d,J=16.0 Hz,H- 8′),4.80(1H,m,H- 4),4.29(1H,m,H- 3),4.25(1H,m,H- 5),2.13- 2.16(2H,m,H- 2),2.00- 2.05(2H,m,H- 6);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:175.4(C- 7),167.7(C- 9′),148.2(C- 4′),145.7(C- 7′),145.5(C- 3′),126.6(C- 1′),121.6(C- 6′),115.2(C- 5′),114.1(C- 2′),113.8(C- 8′),77.6(C- 1),68.0(C- 3),67.9(C- 5),64.9(C- 4),40.7(C- 2),37.2(C- 6)。以上数据与文献[19]报道的基本一致,由此确定化合物12为4- 咖啡酰基奎宁酸。

化合物13淡黄色粉末;FAB- MS:m/z355 [M + H]+;1H NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.57(1H,d,J=16.0 Hz,H- 7′),7.05(1H,d,J=2.0 Hz,H- 2′),6.94(1H,dd,J=2.0,8.0 Hz,H- 6′),6.77(1H,d,J=8.0 Hz,H- 5′),6.29(1H,d,J=16.0 Hz,H- 8′),5.38(1H,dd,J=5.2,10.0 Hz,H- 5),4.13(1H,dd,J=2.8,6.0 Hz,H- 3),3.68(1H,dd,J=2.8,10.0 Hz,H- 4),2.15(1H,dd,J=2.8,15.2 Hz,H- 6a),2.10(1H,m,H- 2a),2.00(1H,m,H- 2b),1.94(1H,dd,J=2.8,15.2 Hz,H- 6b);13C NMR(CD3OD,100 MHz)δ:181.1(C- 7),169.3(C- 9′),149.7(C- 4′),147.0(C- 7′),146.9(C- 3′),127.9(C- 1′),123.1(C- 6′),116.6(C- 5′),115.7(C- 2′),115.2(C- 8′),77.9(C- 1),75.2(C- 4),73.2(C- 5),72.8(C- 3),40.8(C- 2),39.2(C- 6)。以上数据与文献[20]报道的基本一致,由此确定化合物13为5- 咖啡酰基奎宁酸。

化合物14白色粉末;FAB- MS:m/z517 [M + H]+;1H NMR(DMSO,400 MHz)δ:7.79(1H,d,J=16.0 Hz,H- 7′),7.57(1H,d,J=16.0 Hz,H- 7′′),7.04(2H,s,H- 2′,2′′),6.98(2H,dd,J=1.6,8.0 Hz,H- 6′,6′′),6.77(2H,d,J=8.0 Hz,H- 5′,5′′),6.21(1H,d,J=16.0 Hz,H- 8′),6.20(1H,d,J=16.0 Hz,H- 8′′),5.22(1H,ddd,J=4.0,7.6,8.0 Hz,H- 5),4.06(1H,m,H- 3),3.60(1H,m,H- 4),2.27- 2.35(3H,m,H- 2,6a),2.00- 2.05(1H,m,H- 6b);13C NMR(DMSO,100 MHz)δ:173.3(C- 7),166.6(C- 9′),165.8(C- 9′′),149.0(C- 4′),149.0(C- 4′′),146.2(C- 7′),146.2(C- 7′′),145.7(C- 3′),145.6(C- 3′′),126.1(C- 1′),126.1(C- 1′′),121.9(C- 6′),121.8(C- 6′′),116.4(C- 5′),116.3(C- 5′′),115.4(C- 2′),115.1(C- 2′′),114.8(C- 8′),114.8(C- 8′′),80.1(C- 1),71.6(C- 4),70.6(C- 5),68.2(C- 3),36.5(C- 2),34.8(C- 6)。以上数据与文献[21]报道的基本一致,由此确定化合物14为1,5- 二-O- 咖啡酰基奎宁酸。

4 结果与讨论

本实验对木通果实预知子进行了系统的化学成分研究,从乙酸乙酯部位和正丁醇部位分离得到14个非三萜皂苷类化合物,其中9个为首次在预知子中得到。预知子作为木通科木通属植物的果实,具有多种生物活性和用途。目前,其化学成分研究多集中在三萜皂苷类成分,并且在探讨其生物活性物质基础时,多以三萜皂苷类为指标性成分。本实验对预知子极性更强的正丁醇部位进行系统分离纯化,得到了多个酚酸类、咖啡酰奎宁酸类及苯乙醇苷类等非三萜类成分,不仅丰富了木通属植物的化学成分类型,更为寻找新的生物活性打下基础。

咖啡酰奎宁酸类化合物具有很强的抗氧化活性,同时具有抗炎、抗菌、抗病毒及降脂降糖的作用。绿原酸和异绿原酸A、B、C对DPPH和羟基自由基具有较好的清除作用,并随浓度升高而逐渐增大[22]。咖啡酰奎宁酸类化合物具有体外抗类风湿性关节炎活性,与模型组比较,8个咖啡酰奎宁酸化合物均可不同程度抑制MH7A细胞的增殖和细胞因子的分泌,其中3-O- 咖啡酰奎宁酸(3- CQA)作用最明显,其次是1,3-O- 二咖啡酰奎宁酸(1,3- DCQA),其作用机制可能与抑制MAPK 信号通路的激活,降低 NF- κB 活性,抑制下游炎症因子表达,进而减轻炎症反应有关[23]。另外,天然来源的咖啡酰基奎宁酸类化合物具有体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的活性。CPE 结果显示咖啡酰基奎宁酸类化合物均表现出较好的抗RSV作用,其中活性最好的4,5- 双咖啡酰基奎宁酸甲酯(4,5- DCQA),优于阳性对照药物利巴韦林[24]。

苯乙醇苷类成分(PhGs)在药用植物中广泛存在,是一类以β- 葡萄糖为母核分别与苯丙烯酸酯化、与苯乙醇苷化形成的含有酯键及氧苷键的天然水溶性糖苷。目前大量研究表明,该类成分具有抗菌、抗炎、保肝、抗病毒、抗氧化、免疫调节、增强记忆、强心等多种药理活性[25]。红景天苷具有广泛的抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗疲劳等作用,其苷元酪醇(tyrosol)是最早在橄榄油中发现的生物酚类,具有抗氧化、抗炎和抗癌等作用。已有研究发现红景天苷通过静脉和灌胃给药,在SD大鼠体内组织和器官中可检测到其去糖基的代谢产物酪醇。预示红景天苷的抗氧化、抗炎等作用部分是通过代谢成苷元酪醇而发挥作用[26]。展望预知子在以后的活性机制研究方面,可以从三萜类和非三萜类两个维度进行深入研究,以期为全面客观了解预知子生物活性提供依据。

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