张秋楠, 喻娟娟,2, 秦 智, 戴绍军*

(1.上海师范大学 生命科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234;2.东北林业大学 盐碱地生物资源环境研究中心,黑龙江 哈尔滨 150040)

0 引 言

一氧化氮(NO)参与植物种子萌发、根生长、气孔运动、开花等多种生物学过程的调节,在植物胁迫应答过程中也具有重要作用[1].NO通过参与调节蛋白质S-亚硝基化、金属亚硝基化和酪氨酸硝化等过程影响蛋白质的功能.其中,蛋白质S-亚硝基化是NO与蛋白质半胱氨酸(Cys)残基共价连接形成S-亚硝基硫醇(-SNO)的过程.蛋白质S-亚硝基化会影响其结构、活性、亚细胞定位,以及与其他蛋白质相互作用等[2].

线粒体在依赖S-亚硝基化的NO信号通路中起关键作用.线粒体是腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成的重要场所,并参与凋亡信号转导.线粒体中含有大量的硫醇和过渡金属,为-SNO的生成提供了场所.此外,在线粒体丰富的膜系统中容易积累亲脂性分子,如NO,因此成为植物中NO作用的主要靶细胞器.例如,NO可与复合物IV(细胞色素c氧化酶)的双核CuB/血红素a3位点结合,从而抑制该酶的活性[3].

迄今为止,研究者们应用蛋白质组学技术对拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticumaestivum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、酸橙(Citrusaurantium)、芥菜(Brassicajuncea)和落地生根(Kalanchoepinnata)的叶片和幼苗应答各种胁迫(如S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO,细胞内NO的主要存在形式)、H2O2、低温、盐和干旱胁迫)的S-亚硝基化蛋白质进行了分析[4-13].其中,多种植物线粒体S-亚硝基化蛋白质参与调控光呼吸、三羧酸循环、氧化磷酸化、活性氧分子(ROS)稳态、蛋白质加工与周转,以及物质代谢等过程.

1 S-亚硝基化调节光呼吸相关酶的活性

NO可通过调控线粒体光呼吸相关酶的活性来调节光呼吸代谢.在线粒体中,二分子甘氨酸(Gly)在甘氨酸脱羧酶复合体(GDC)和丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)作用下生成丝氨酸(Ser).这一步可分为2个反应:一分子Gly可被GDC脱羧生成N5,N10-亚甲基四氢叶酸(m-THF),释放CO2和NH3;另一分子Gly在SHMT作用下,与m-THF反应生成Ser.GDC由含硫辛酰胺辅基的H蛋白,含磷酸吡哆醛辅基的P蛋白,含四氢叶酸的T蛋白和L蛋白组成.蛋白质组学结果表明:GDC-H蛋白在用物质的量浓度为250 mmol·L-1的GSNO[10]处理过的悬浮培养细胞中,发生S-亚硝基化修饰,并且在4 ℃下处理过的拟南芥叶片中亚硝基化程度增加(图1)[12].PALMIERI等[3]发现在用物质的量浓度为1 mmol·L-1GSNO处理过的拟南芥叶片中,GDC-H1、GDC-P1和GDC-P2这3个亚基都被鉴定为S-亚硝基化靶蛋白.此外,研究表明氧化还原剂可调节植物叶片和离体线粒体中的GDC活性,也证实NO可抑制GDC活性,并且该过程与GDC脱羧亚基的几个Cys残基的S-亚硝基化和谷胱甘肽化密切相关.此外,GDC活性的抑制与拟南芥应答细菌激发子超敏蛋白的相关反应直接相关,并且这种抑制能够激活氧化还原应答机制,从而引发线粒体紊乱和细胞死亡[3].该结果表明线粒体中的NO和ROS之间存在相互关联,并且在植物应答胁迫过程中发挥重要作用.

在用物质的量浓度为1 mmol·L-1GSNO处理过的拟南芥叶片中,SHMT也发生了S-亚硝基化修饰[3].由此可知,NO可通过调节GDC和SHMT的S-亚硝基化水平来影响Gly转化为Ser的过程,进而影响光呼吸代谢.

图1 S-亚硝基化蛋白质组学研究揭示的植物线粒体NO信号调控网络.缩写:CBS,胱硫醚β-合酶;Cpn,分子伴侣;DLDH,二氢硫辛酰胺脱氢酶;GDC,甘氨酸脱羧酶;GDH,谷氨酸脱氢酶;Hsp,热激蛋白;IPMDH,3-异丙基苹果酸脱水酶;MDH,苹果酸脱氢酶;Mn-SOD,锰超氧化物歧化酶;Prx,过氧化物氧化还原酶;SDH,琥珀酸脱氢酶;SHMT,丝氨酸羟甲基转移酶;SUCA2,琥珀酰-CoA合成酶

2 S-亚硝基化修饰调控三羧酸循环

线粒体中的三羧酸循环能为植物生长发育和逆境应答提供能量.在此过程中,草酰乙酸(OAA)与乙酰CoA结合,在一系列酶的催化作用下重新生成OAA,并释放CO2和还原当量(图1).顺乌头酸酶(ACO)可催化柠檬酸转变为异柠檬酸.蛋白质组学研究发现,拟南芥悬浮培养细胞中的ACO在经物质的量浓度为250 mmol·L-1的GSNO处理后发生S-亚硝基化修饰[10].ACO是动物体内主要的NO靶蛋白,动物细胞质ACO可作为关键的氧化还原传感器,还可被NO转化为一种mRNA结合蛋白.与动物ACO类似,烟草(Nicotianatabacum)ACO的酶活性也可被NO所抑制,并且烟草细胞质ACO(NtACO1)也可以通过IRP-1参与mRNA的结合,这说明植物与动物体内的NO调控ACO功能的机制很相似[14].

琥珀酰-CoA合成酶(SUCA)能催化琥珀酰-CoA和琥珀酸的可逆反应,是三羧酸循环中唯一的底物磷酸化反应.琥珀酸脱氢酶(SDH)能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸.在NO过剩突变体(noe1)水稻植株中发现,SUCA2发生亚硝基化修饰[9];在干旱处理4 d的敏感基因型小麦中,SDH的亚硝基化水平增加[7].

线粒体苹果酸脱氢酶(MDH)能催化L-苹果酸脱氢变成OAA,这也是三羧酸循环中的重要步骤.在GSNO处理的拟南芥悬浮培养细胞中,MDH发生S-亚硝基化修饰[3,10];在noe1水稻植株中,MDH的S-亚硝基化程度也增加[9].NO供体可抑制MDH的活性[11].这表明:NO导致MDH发生S-亚硝基化,从而抑制MDH的活性.由此可见,三羧酸循环相关酶的S-亚硝基化可能影响相关反应中间物的生成,从而调控能量代谢以应答逆境.

3 S-亚硝基化影响氧化磷酸化过程

植物细胞代谢时所脱下来的氢可由线粒体呼吸链传递并释放能量,同时偶联驱动ATP合成酶生成ATP,为植物生长发育提供能量.线粒体氧化呼吸链中的铁硫蛋白和NAD(P)H泛醌氧化还原酶分别在水稻noe1突变体和干旱处理4 d的小麦中发生S-亚硝基化修饰.在用物质的量浓度为1 mmol·L-1的GSNO处理后的拟南芥叶片[3]和低温处理4 h的拟南芥幼苗中[12],线粒体ATP合成酶α亚基的S-亚硝基化程度增加;在干旱处理4 d的小麦植株[7]和低温处理4 h的拟南芥幼苗中[12],ATP合成酶β亚基的亚硝基化水平也上升.此外,植物线粒体ATP合成酶α和β亚基在硫氧还蛋白(Trx)互作蛋白质组学研究中都被鉴定为Trx靶蛋白[15].这表明:线粒体ATP合成酶的功能受其亚基的氧化还原状态调节.

4 S-亚硝基化调控ROS稳态

植物线粒体中的锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、抗坏血酸-谷胱甘肽循环酶和Trx/过氧化物氧化还原酶(Prx)系统相关酶等对于维持ROS稳态具有重要作用.SOD是植物细胞抗氧化系统的第一道防线,可催化超氧阴离子自由基(O2•-)歧化生成过氧化氢(H2O2),从而有效降低细胞内O2•-过量积累所造成的伤害.Mn-SOD是一种活性中心含锰金属辅基的SOD,在保护线粒体免受O2•-损伤的过程中发挥重要作用.在经NO供体硝普钠(SNP)预处理后再经物质的量浓度为150 mmol·L-1的NaCl处理16 d的酸橙叶片中,Mn-SOD的亚硝基化水平增加[16].

Prx是一种巯基依赖性非血红素过氧化物酶,可解毒多种不同类型的过氧化物(如H2O2),对线粒体内的氧化还原平衡稳态起重要作用.研究发现:在用物质的量浓度为250 mmol·L-1的GSNO处理后的拟南芥悬浮培养细胞中,线粒体Prx IIF发生S-亚硝基化修饰[10].与此类似,在丁香假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.tomato,PST)侵染拟南芥时,叶绿体Prx IIE的S-亚硝基化水平上升[13].此外,Prx IIE具有ONOO-还原酶活性,其Cys121的体外S-亚硝基化可导致该酶活性丧失.Prx IIE的S-亚硝基化可导致蛋白质酪氨酸硝化的增加,这表明Prx IIE在控制植物ONOO-内源水平的过程中发挥着关键作用[17].

5 S-亚硝基化调控蛋白质加工与周转

维持蛋白质的正确构象,防止错误折叠蛋白质的聚集,对于植物在逆境胁迫条件下的存活至关重要.分子伴侣(Cpn)和热激蛋白(Hsp)有利于稳定蛋白质和细胞膜系统,促进蛋白质的重新折叠,并防止蛋白质的聚集[18].蛋白质组学研究发现多种Cpn和Hsp的S-亚硝基化水平在胁迫条件下发生变化.在经物质的量浓度为250 mmol·L-1的GSNO处理后的拟南芥悬浮培养细胞中,Cpn10和Hsp60发生S-亚硝基化修饰[10].此外,在GSNO处理的落地生根(Kalanchoepinnata)叶片中,Hsp90的亚硝基化水平增加[5].这表明S-亚硝基化可能通过调节Cpn和Hsp的结构与功能应答逆境胁迫.

6 S-亚硝基化影响多种物质代谢

植物线粒体的谷氨酸脱氢酶(GDH)催化α-酮戊二酸与NH4+合成谷氨酸,这是除谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循环途径之外的另一种NH4+同化途径.植物逆境应答与衰老过程中,体内容易积累过量的NH4+,GDH可在缓解植物NH4+中毒过程中发挥作用.在用物质的量浓度为250 mmol·L-1的GSNO处理后的拟南芥悬浮培养细胞中,GDH2的S-亚硝基化水平增加[10].此外,在Pst侵染24 h的耐性基因型(PtoR)番茄(Solanumlycopersicum)中,GDH的氧化水平升高[19].GDH也被鉴定为Trx和谷氧还蛋白(Grx)靶蛋白[15,20].这些意味着NO可能通过调控GDH的氧化还原状态,调控细胞内的NH4+稳态.

3-异丙基苹果酸脱水酶(IPMDH)可催化亮氨酸生物合成中的氧化脱羧步骤和硫代葡萄糖苷的甲硫氨酸链延长.水稻noe1突变体中IPMDH2的S-亚硝基化程度增加.IPMDH已被报道为氧化还原调节酶,番茄抗性品种和油菜保卫细胞中的IPMDH1,以及拟南芥悬浮培养细胞中的IPMDH2在应答Pst、茉莉酸甲酯和H2O2处理时氧化水平分别上升[19,21].油菜和拟南芥中IPMDH1的活性受氧化剂(如H2O2和CuCl2)和还原剂(如二硫苏糖醇(DTT)和Trxm)的调节,且还原型IPMDH1的活性更高[21].这表明:IPMDH的功能可能受氧化还原系统的调节.

二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)属于黄素蛋白氧化还原家族,是组成线粒体基质中的丙酮酸脱氢酶复合体、支链氨基酸-脱氢酶复合物,以及GDC的必需组成成分.研究发现:在GSNO处理的拟南芥[3]和马铃薯(Solanumtuberosum)叶片中[8],以及应答NaCl胁迫的拟南芥悬浮培养细胞[6]和低温处理的拟南芥幼苗中[12],DLDH1和DLDH2的S-亚硝基化水平均上升.这表明NO通过调节DLDH的S-亚硝基化水平影响其功能.

胱硫醚β-合酶(CBS)参与转硫代谢,可催化丝氨酸和同型半胱氨酸合成胱硫醚.在用物质的量浓度为250 mmol·L-1的GSNO处理后的拟南芥悬浮培养细胞中,CBS发生S-亚硝基化修饰[10].这表明NO可通过调节代谢过程关键酶的S-亚硝基化水平,从而影响代谢物的生物合成过程.

7 结 语

蛋白质S-亚硝基化修饰在植物线粒体中发挥了重要作用.蛋白质组学研究发现了植物线粒体中多种S-亚硝基化蛋白,它们参与线粒体中光呼吸、三羧酸循环、氧化磷酸化、ROS稳态、蛋白质加工与周转,以及物质代谢等过程(图1).这表明NO可通过调节蛋白质的S-亚硝基化水平调控多种信号与代谢途径.今后,随着蛋白质S-亚硝基化鉴定技术的发展,可以开展S-亚硝基化蛋白的定量分析,为理解植物体内NO调控网络提供更有价值的信息.