董晓春

H7N9禽流感自2013年在中国华东地区被发现以来，已经在人群中出现了5次疫情：其中从疫情开始到第5次疫情结束，全球共报告人感染H7N9禽流感实验室确诊病例1 567 例［1］。其中从2016 年10月—2017年9月的第5次疫情报告的感染人数和死亡人数均远超过前4 波疫情，引起了国内外学者的广泛关注［2］。特别是从第5 次疫情的患者中分离到了高致病性的H7N9禽流感病毒（HPAI H7N9），鉴于既往人感染H7N9 禽流感后的严重程度，HPAI H7N9禽流感病毒的出现可能会造成更大的危害［3］。近期多国的学者也对HPAI H7N9 禽流感的流行病学、分子生物学等方面进行了广泛的研究。本文综合相关研究对HPAI H7N9 禽流感病毒各方面生物学研究进展做一综述。

1 H7N9禽流感病毒的进化

1.1 基本特征 在中国首次发现的新的H7N9禽流感病毒属于正黏病毒科甲型流感病毒属。甲型流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素（haemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性的不同可分为多个亚型，H7N9属于其中一个亚型。根据基因测序结果，2013年新出现的H7N9禽流感病毒HA基因与浙江鸭群的H7N3 亚型（A/duck/Zhejiang/12/2011）高度同源，NA 基因与韩国水鸟中的H7N9（A/wild bird/Korea/ A14/2011）同源，内部的6 个基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）分别来自中国东南部（上海、浙江）的家禽以及北京地区的禽鸟的两种H9N2亚型［4］。

由于人类上呼吸道组织和气管主要含有唾液酸α-2，6 型受体，α-2，3 型受体多见于禽类呼吸道表面。而禽流感病毒通常与禽类的唾液酸α-2，3受体结合。2013 年新发现的H7N9 禽流感病毒的HA 基因在G186V、Q226L 和T160A 等位点发生氨基酸替换，这些突变使其可以同时结合人类的唾液酸α-2，6受体和禽类的α-2，3受体，从而获得了感染人类的能力［5-6］。禽流感病毒是根据其对禽类致病性的强弱可分为高致病性和低致病性，由于2013年出现的H7N9 禽流感病毒对禽类来说致病比较温和，且在HA蛋白的裂解位点周围只存在单个碱性氨基酸，未观察到与高致病性禽流感相似的氨基酸序列，因此被认定为低致病性的禽流感病毒［7］。

1.2 病毒进化与高致病性演变 中国低致病性H7N9 禽流感病毒分离株的核酸序列分析表明病毒可分为长三角分支及珠三角分支两种体系株，长江三角洲地区被认为是2013年开始出现的H7N9禽流感疫情的源头［8］。同年8 月广东分离的1 株病毒株（A/Guangdong/1/2013）与之前测序的长三角H7N9病毒株相比，其NS和NP基因与当地流行的H9N2亚型禽流感病毒更为接近，被称为珠三角分支。后者系从前者进化而来，两者在传播力和致病性上无明显区别［9］。第2、3次疫情（2013年10月—2015年9月）以长三角和珠三角为源头向其他地区辐射，从华东逐渐向华南地区转移，在此过程中产生了重组H7N9病毒，新的H7N9 变异体含有内部基因片段PB1、PB2、NP和NS与当地禽类循环H9N2菌株密切相关。而新的变异也引起了H7N9 禽流感病毒在抗原性、耐药性方面出现一些变化［10］。与前3次疫情中分离的病毒相比，第4 次疫情中分离到的H7N9 毒株在HA 和NA 基因中的突变较少，在病毒聚合酶基因中鉴定出哺乳动物适应的遗传标记的频率与前3次疫情保持一致［11］。

从第5 次疫情开始到2016 年12 月分离的病毒株的基因特征与前4 次疫情中分离的病毒相似，属于低致病性禽流感病毒（LPAI H7N9），直到2017 年广东省疾病预防控制中心对分离到的毒株A/Guangdong/Th008/2017 和A/Guangdong/Th005/2017进行了基因测序分析，发现在该2株病毒的HA链接肽位置发生了基因插入性突变，HA蛋白水解切割位点HA1 和HA2 连接区域获得4 个氨基酸（KRTA）的插入突变，此类基因引起病毒对家禽毒力的增强，提示经过4 年的进化和突变，中国已出现HPAI H7N9禽流感病毒［12］。Xiang 等［13］从第5 次疫情中共发现有69 个HA 基因插入4 种类型的HPAI 序列，分别是-PKGKRIAR/GLF-、-PKGKRTAR/GLF-、-PKRKRAAR/GLF-、-PKRKRTAR/GLF-。这些HPAI H7N9病毒的HA序列在核苷酸水平上比LPAI具有较高的遗传同源性。同时，HPAI和LPAI H7N9病毒的NA 和6 个内部基因在核苷酸水平上表现出相似性。

2 高致病性H7N9禽流感病毒

2.1 HPAI H7N9 病例流行病学特征 截至2018 年8 月，全球共报告32 例人感染HPAI H7N9 病例，这32例病例来自我国台湾地区（该病例曾前往广东）、广西、广东、湖南、陕西、河北、河南、福建、云南省，其中广西壮族自治区报告的病例最多，其次为广东省。所有病例发病日期均在2017 年10 月之前［14］。Zhou等［15］对广西、湖南、广东的8例HPAI H7N9病例临床特征分析发现，8例患者中位年龄57岁（28～71岁），男4例（50%）；大多数（75%）病例患者生活在农村地区，并且在发病10 d 内全部接触家禽。8 例患者发病到入院时间为2.5 d（0～5 d），均接受奥司他韦治疗，发病到用药为4 d（1～8 d）。4例患者发病后平均6.5 d（5～44 d）死亡，4 例痊愈，平均住院29 d（21～52 d）。与LPAI 病例特征比较发现，HPAI 患者更多生活在农村地区（88%vs.47%），发病前曾接触病禽或死禽（50%vs.16%），发病到住院时间较短（2.5 dvs.5 d）。在年龄、性别、基础慢性病患病率、发病至抗病毒治疗的中位时间、接受奥司他韦治疗、重症监护病房入院或机械通气的患者比例方面无显著性差异。尽管HPAI 患者从发病到死亡的中位时间较LPAI 患者短（6.5 dvs.13 d），总体病例死亡率高于LPAI患者（50%vs.37%），但差异无统计学意义。广东省对本省的9 例HPAI H7N9 病例与LPAI 病例特征做了比较，两者在性别、年龄、临床表现方面并无差异，两者活禽市场接触史的比例也基本相似。但HPAI 病例接触活禽或死禽的比例均高于LPAI 病例，HPAI 病例在后院饲养家禽比例明显高于LPAI病例（77.8%vs.29.4%）。同时HPAI 患者从入院到出院的时间较LPAI患者显著延长。在死亡患者中，更多的HPAI 患者从住院到死亡的持续时间大于21 d（HPAI：3/5；LPAI：2/22）［16］。

2.2 变异来源 为追溯HPAI H7N9共同的起源，中国的学者对25株人感染的HPAI H7N9与14株禽源HPAI H7N9 病毒做了全基因测序；结果发现所有的HPAI H7N9 病毒都可以归类为单个基因簇，被称为HPAI H7N9 簇。而HPAI H7N9 簇完全归类为长江三角洲谱系。通过共祖时间（TMRCA）分析发现，HPAI H7N9 的H7 基因来源时间估计为2016 年5 月下旬。所有的禽和人的HPAI H7N9 病毒分离株均来源于广东省分离的LPAI H7N9病毒。广东省可能是LPAI H7N9 病毒获得4 个氨基酸插入并突变为HPAI H7N9病毒的关键地区。HPAI H7N9谱系中观察到的几个亚群，包括来自广西、湖南、陕西和内蒙古等地区的HPAI H7N9病毒均被归类为广东亚群，表明该亚群的HPAI H7N9病毒可能来源于广东省，随后传播到其他地区［17］。Su 等［18］对全球共享禽流感数据倡议组织（GISAID）的数据库和核酸序列数据库（Genbank）中第5 次疫情中出现的HAPI H7N9病毒序列分析，同样发现所有的HPAI H7N9序列均来自珠江三角洲地区，表明这个地区最有可能是这种病毒的来源。我国台湾地区分离的A/Taiwan/1/2017（H7N9）的HA 和NA 基因与大陆地区分离的病毒同属于长三角分支。它的6个内部基因中，PB1和M 基因与A/Anhui/1/2013 疫苗株及2016、2017 年新近从江苏省、浙江省、福建省和广东省分离的病毒位于同一个分支，聚类分析则显示其PB2、PA 和NS 基因与早期的H7N9 亚型归为一类，与2016—2017 年新近的病毒无关［19］。

2.3 突变情况 对广东HPAI H7N9 分离株A/Guangdong/17SF003/2016 和A/Guangdong/17SF006/2017 测序发现，HA 蛋白的226L 变回为226Q，这一突变与LPAI H7N9的Q226L突变相反。既往研究证明Q226L突变可提高病毒对哺乳动物唾液酸受体的结合能力［20］。2 株HPAI H7N9 病毒与典型的LPAI H7N9病毒相比，除具有双重受体α-2，6和α-2，3结合特性以外与α-2，3 受体的亲和力明显增加。与LPAI H7N9 病毒不同，HPAI H7N9 病毒在胰蛋白酶存在或不存在时具有相似的复制能力，表明其胰蛋白酶独立特性［21］。从台湾毒株的分析结果看，HA中未发现Q226L/I 和G228S 这2 个与人类受体高亲和力结合的突变，但有S138A、T160A 和G186V 共3 个突变，与病毒与人类受体的结合能力有关；PB2蛋白中有E627K 的替换，与病毒的复制能力增加有关；PB1-F2 蛋白有90 个氨基酸，NS1 蛋白中存在P42S和D92E的替换，都可能使H7N9对实验动物的毒力增强［19］。另外，Yang 等［17］同时对28 株人感染HPAI H7N9分离株与21株禽源HPAI H7N9分离株做基因测序，结果显示所有21 株禽源毒株和25/28 株人源毒株分别发生G186V 和L226Q 的替换，L226Q 替换虽减弱了病毒与哺乳动物唾液受体的结合能力，但研究发现HA蛋白中G186V单独存在也可增加病毒与受体的亲和力［6］。在28 株人源毒株的PB2 蛋白中，分别出现T271A、Q591K替换各1株，E627K替换14株，D701N替换4株，这些置换与小鼠聚合酶活性增加或毒力增强有关。但在禽源HPAI H7N9 中未检测到这样的突变。而此类突变通常在禽流感病毒传播到哺乳动物宿主时常被观察到［22-23］。

2.4 抗原性分析 为了研究HPAI 和LPAI H7N9病毒之间的抗原性差异，Zhu 等［21］使用雪貂抗血清对A/anhui/1/2013（野生型）、A/anhui/1/2013（反向遗传株）和A/shanghai/2/2013（野生型）进行雪貂抗血清测定。抗原分析表明，除A/hunan／06948／2017 和A/anhui/60933/2016之外，所有的LPAI H7N9病毒与H7N9疫苗株A/anhui/1/2013（野生型或反向遗传株）或A/shanghai/2/2013 的雪貂抗血清反应良好。然而，HPAI H7N9（A/Guangdong/17SF003/2016 和A/Guangdong/17SF006/2017）对LPAI H7N9疫苗株的抗血清表现出低或无反应性。

2.5 对动物的致病力 联合国粮食及农业组织统计，截至2018年9月5日，全球共从动物或外环境中检出58 株HPAI H7N9，其中46 株来自鸡、2 株来自鸭、10株来自环境标本［24］。HPAI H7N9的致病性方面，中、美、日三国联合研究发现，以HPAI H7N9 毒株A/Guangdong/17SF003/2016（GD/3）为研究材料，分析其在不同小鼠、雪貂和食蟹猴等动物模型上的致病力和传播力，以GD/3 为骨架，构建了2 株携带NA R294K 耐药性突变的重组病毒，分别命名为rGD/3-NA294R 和GD/3-NA294K，以及LPAI H7N9（A/anhui/1/2013），与其他两株病毒相比，HPAI H7N9（GD/3）和药物敏感毒株（rGD/3-NA294R）对小鼠和雪貂的致病力更强，4 株病毒在雪貂动物模型上通过空气飞沫传播的能力差异无统计学意义，提示HPAI H7N9 病毒相对于LPAI H7N9 病毒来说，传播力没有改变。耐药毒株（rGD/3-NA294K）在细胞和动物组织的复制能力要低于对应的敏感病毒［25］。Shi 等［26］发现分离得到的HPAI H7N9 在48 h 内使鸡100%死亡，静脉致死系数为3，从生物学上证明对鸡具有高致病性；HPAI H7N9感染小鼠或雪貂后，致病性同LAPI H7N9 病毒类似，但临床症状较轻；HPAI H7N9 病毒感染雪貂后，在雪貂体内复制一代后可获得适应哺乳动物关键突变，PB2基因627 位突变为K或701位突变为N，突变后的毒株对小鼠的致病力增加万倍以上，可引起雪貂严重发病、死亡。HA和PB2基因的联合突变增强了对哺乳动物的致病性［26］。

2.6 耐药与治疗药物 既往对LPAI 的研究发现，NA 的神经氨酸酶抑制剂的耐药位点突变包括：E119V、R292K、R152K 和A246T。这4 个耐药突变均在人感染LPAI H7N9 中检测到［8，27］。对禽类研究发现，当野鸭暴露于低浓度的奥司他韦时，发生了I222T位点的突变，从而获得一定的耐药性［28］。对于HPAI H7N9，广东省对2 株HPAI H7N9（A /Guangdong/Th008/2017和A/Guangdong/Th005/2017）测序发现，A/Guangdong/Th008/2017 的PB2 未发现突变，但发现经奥司他韦治疗后NA 中出现耐药性突变R292K。据报道，在NA 蛋白中具有R292K 突变的H7N9病毒对多种基于神经氨酸酶抑制剂的药物具有耐药性［29］。A/Guangdong/Th005/2017PB2 有2个突变K526R和E627K，但未发现NA 具有对奥司他韦的抗性［12］。综合禽源和人源HPAI H7N9 对比发现［17］，禽源高致病性毒株NA 蛋白未发生R292K突变，提示禽源毒株尚未产生对NA抑制剂类药物的耐药性；而同期人源部分毒株发生了R292K 突变。在2 株人源病毒分离物中发现NA 蛋白突变E119V和H274Y，既往报道这2 个突变也与病毒的耐药性有关［30-31］。在禽源病毒中同样没有检测到以上的替换。所有取样的HPAI H7N9毒株，不论人或禽源所有分离株的M2 蛋白均发生了S31N 变异，表明毒株对金刚乙胺的敏感性降低。

鉴于HPAI H7N9 对传统的抗流感药物出现不同程度的耐药，一些新型的药物也被运用于H7N9的治疗。香港的研究者发现一种新药，名为DAS181（FludaseTM）。与奥司他韦等神经氨酸酶抑制剂类药物不同，DAS181 的主要成分是唾液酸酶融合蛋白，其作用的对象是细胞本身，使宿主细胞表面的唾液酸受体失去活性，流感病毒就无法与受体结合，也就无法附着细胞。由于DAS181不直接作用于病毒，不容易出现病毒耐药性问题。DAS181在鼠、MDCK细胞、分化的人类上呼吸道组织以及支气管组织上的试验取得了良好的疗效［32］。利巴韦林作为具有良好特性的广谱核苷酸抑制剂，可以通过RNA聚合酶停止病毒RNA 和mRNA 的合成和加帽。无论通过体内还是体外试验证实利巴韦林对神经氨酸酶抑制剂有抗药性的H7N9病毒感染有良好的效果［33］。美国的一项研究发现一种新型的天然Ⅰ型干扰素，称之为“Alferon N”，该药物曾被用作严重急性呼吸综合征（SARS）的治疗，该研究通过体内试验发现，对于神经氨酸酶抑制剂耐药株与不耐药株，Alferon N均能有效抑制H7N9病毒的复制［34］。另外一种药物被称为VIS410，是一种靶向甲型流感病毒株的单克隆抗体，该药物可以通过结合血细胞凝集素来防止流感病毒与宿主细胞融合，从而终止病毒的复制，达到清除病毒治疗流感的目的。试验发现，该药物能有效降低试验小鼠的病死率以及肺内的H7N9病毒载量［35］。

2.7 疫苗 针对2013 年新出现的H7N9 禽流感病毒，世界卫生组织（WHO）采用首次分离得到的2 株H7N9 禽流感毒株A/Anhui/1/2013 和A/Shanghai/2/2013作为疫苗候选株的母株［36］，目前已有禽用疫苗已在中国大陆地区开展免疫接种，如重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株H7N9-Re1 株）已在南方地区推广，并取得了良好的效果［37］。另外多种人用疫苗已在临床试验阶段，其中分为几个类型，如经反向遗传技术改造的禽流感病毒灭活疫苗，包括鸡胚生产和细胞生产的灭活疫苗［38-39］，基因工程活载体疫苗包括新城疫、杆状病毒等为载体表达的重组疫苗，基于禽流感病毒HA 蛋白的DNA 疫苗等［40-42］。鉴于第5 次疫情中的H7N9高致病性突变株，且对LPAI H7N9 疫苗株抗原性出现改变，WHO 在2017 增加HPAI 毒株A/Guangdong/17SF003/2016 为候选母株［43］，中国流感中心的研究人员利用反向遗传技术（reverse genetics RG），以A/Puerto Rico/8/34 内部基因为骨架，以A/Guangdong/17SF003/2016为模板，构建了HPAI H7N9疫苗候选株RG-SF003，为下一步HPAI H7N9 疫苗的生产提供基础［44］。

3 小结

第5次疫情中出现的HPAI H7N9禽流感病毒在基本流行病学特征虽未出现明显变化，但农村病例、职业人群病例增多，同时病毒对动物的致病性增强。在抗原性和耐药性方面发生了一定变化。因此，通过对家禽、环境和人群的持续监测，进一步研究HPAI H7N9 禽流感病毒的流行病学特征，加快新型抗病毒药物和疫苗的研发等，对HPAI H7N9疫情的预防和控制具有重要意义。