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(1.大连海洋大学 海洋科技与环境学院,辽宁 大连 116023； 2. 辽宁省海洋牧场工程技术研究中心，中国水产学会海洋牧场研究会，辽宁 大连 116023；3.中国水产有限公司，北京 100160)

随着全球水产养殖产量的快速增长，鱼类养殖福利问题正成为许多国家的研究热点，研究鱼类的听觉特性就显得尤为重要[1]。淡水音响驯化牧场的发展中，利用鱼类的听觉特性，在养殖业中使用鱼群声诱控制投饵技术，可减少饲料的沉积，提高饲料利用率[2]，从而较好地改善养殖水域环境，使淡水养殖鱼类健康、快速发展。鱼类的听觉器官结构，在功能上发挥着不同的作用。鱼类的内耳可感觉16～1300 Hz的振动[3-4]，它是由耳石、听壶、听觉毛细胞和神经系统组成，其中听觉毛细胞可以将声信号转换为电信号，从而被神经系统识别[5]，耳石则可以辨别声音振动的方向；鳔的主要作用是声音的“共鸣箱”或“共振器”，对声波振动起到强化作用，因其鳔的结构不同，对声音的敏感程度也不尽相同[6]，如具有韦伯氏器的鲤形目Cypriniformes和鲇形目Siluriformes鱼类则在听觉频域上更为宽广，最高可听到2～5 kHz频率的声音；侧线也是鱼类的听觉器官，一般分布于鱼体两侧，并沿整个身体长轴，随水平肌隔的走向分布直达尾部，呈线状排列，头部也有发达的侧线器官[7]，鱼类能够通过侧线感受到水体中的水流压力、低频振动、温度变化等信号，一般侧线能够感觉到的低频振动为10～150 Hz[4]。因此，鱼类可利用以上听觉器官，综合地感知水体中的声音[4,8]。

目前，关于鱼类听觉特性的研究主要集中在听觉阈值[9]、环境噪声对鱼类听觉的遮蔽效果、音频辨别能力、声源定位能力，以及对学习音的记忆力等[10-12]。其中，听觉阈值是鱼类最基本的听觉特性，是指鱼类刚能听到声音的最小声压值，通常是以听觉阈值曲线图的方式来表示，横轴为频率，纵轴为听觉阈值，曲线的最低点表示整个听觉敏感频率范围中的最敏感频率所对应的最小声压值[13]。根据曲线，不仅可以了解鱼类在各种频率下的听觉阈值，而且还能判断出它们的可听频率范围。

Green等[14]提出，鱼类的听觉阈值只是一个相对阈值，可能随着时间和生理状态而改变，因此，测量鱼类听觉阈值的试验方法至关重要。听觉阈值的测定方法主要有心电图法(Electrocardiograph，以下简称ECG)、听觉脑干反应法(Auditory brainstem response，以下简称ABR)和行为法(Behavior)。

ECG法，通过将声和电刺激相结合，建立条件反射，使鱼对声音产生记忆，并根据心电图变化判断鱼对声音的反应。20世纪70—80年代，英国科学家对鱼类听觉能力和行为反应进行了大量观察研究，Chapman[15]和Hawkins等[16-17]采用心电图方法测量了太平洋鳕Gadusmacrocephalus、大麻哈鱼Salmoniformes、鲐chubmackerel等对声音的反应，并出版了《Under Water Sound and Fish Behaviour》和《Sound Reception in Fish》等专著；国内，侍炯等[18]进行了150 Hz矩形波断续音对褐菖鲉Sebastisousmarmoratus音响驯化的试验研究。

ABR法，是指从鱼的中枢神经系统导出神经的动作电位，根据其电位的变化判断鱼对声音刺激的反应。Kenyon等[19]首次使用ABR技术测得了鱼类的听觉阈值，指出ABR技术是一种非侵入性、无须复杂行为驯化、测量迅速、对鱼体无损伤、试验鱼可重复利用的高效技术手段，从此该方法被广泛应用于鱼类听觉损伤研究[20-22]、声暴露试验等研究中[23-25]。

行为法是指将行为学和动物心理学的方法相结合，通过驯化来观察鱼类对声音的行为反应，以此判断鱼类的听觉能力[26]。在早期行为学驯化试验中[27-29]，在指定区域内播放特殊的声音，当鱼靠近该区域时，给予鱼以食物奖励，以此来观察研究鱼类的听觉能力。此方法的缺点是，当接近听觉阈值时，鱼的行为反应模糊不清，无法精确测量。

鲫CarassiusauratusLinnaeus隶属于骨鳔类鱼，具有韦伯氏器[3]，常见于欧亚地区，广泛分布于中国各地水域，是中国重要淡水经济鱼类。本试验中，以鲫为研究对象，分别采用ECG法和ABR法研究了鲫的听觉特性，测定了其听觉阈值和绘制了听力曲线，并比较了两种方法的优、缺点和准确性，旨在为研究淡水鱼类的听觉特性提供理论参考，同时也为发展建设淡水音响驯化型牧场提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用鲫购于辽宁省大连市某养殖场。试验前，将试验鱼在室内玻璃钢水槽(4.5 m2.0 m1.0 m)中暂养5 d，水温为14.4～15.1 ℃。试验过程分别采用ECG法和ABR法，每个试验选取20尾活力较好的试验鱼，共40尾，体质量为262.6～321.8 g，体长为21.1～23.3 cm。

1.2 方法

注： a为扬声器，b为试验水槽，c为试验鱼，d为刺激电极，e为ECG电极，f为固定框架，g为海绵垫，h为噪声解析系统Note: a,speaker; b,water tank; c,fish; d,stimulating electrode; e,ECG electrode; f,fixed frame; g,rubber mat; h,hydrophone directivity图1 ECG法试验装置图Fig.1 Test installation diagram of ECG method

ABR法试验装置由隔音室、声刺激系统及数据记录系统组成(图2)。其中，隔音室同上；声刺激系统采用水下扬声器(UW-30，中国)作为刺激声源，距离鱼头部正下方35 cm处放置，水下扬声器由金属网包裹；而后导入到放大器(D-75A，Crown，中国)；数据记录系统包含TDT系统处理器(RZ6，美国)和TDT前置放大器(RA4LI，美国)，并结合计算机进行数据分析，同时用水下声音测量系统(Aquafeeler Ⅳ，Roland，日本)对环境噪声进行实时监测，并通过SigGenRZ软件进行图像记录与分析。

注： a为前置放大器，b为固定框架，c为水下扬声器，d为噪声解析系统，e为减振沙，f为记录电极，g为参比电极，h为接地线，i为试验鱼，j为试验水槽Note: a, preamplifier; b, fixed frame; c, underwater speaker; d, hydrophone directivity; e,vibration attenuation sand; f,recording electrode; g, reference electrode; h, ground lead; i, fish; j, water tank图2 ABR法试验装置图Fig.2 Test installation diagram of ABR method

1.2.2 ECG测定方法 将试验鱼放于浓度为0.3 mg/L的鱼安定(MS-222)麻醉水中，6～8 min后取出置于手术盘上，用直径为1.0 mm的空心针从试验鱼左胸鳍下基部刺入，沿心脏壁深入后从右胸鳍上基部刺出，把外径为0.5 mm的绝缘镀银线贯入刺针空心部后，拔出刺针，将剥去绝缘壁长为2.0～2.5 mm部分对准心脏部位，用于采集心跳信号，鱼体两侧电极线用橡胶颗粒固定以防止电极错位，而后将试验鱼放入水槽中特制的固定鱼装置上，电极线另一端与心电图机采集电极相连；心电图机另一根电极线置入水中以形成回路。试验过程中，利用声电结合方式对试验鱼进行驯化，分别在频率为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000 Hz时，采用正弦波连续音对试验鱼进行声音驯化，驯化采取放声1 s后，立刻用6 V直流电以0.1 s间隔刺激试验鱼，随后迅速打氧，以3 min作为一个驯化间隔，共驯化7次；而后在12个频率中以声压级2～3 dB(re 1 μPa，下同)递减方式减小放声，通过示波器观测试验鱼的心跳变化，并结合背景噪声实时监测系统判断听觉阈值，直至观测到心跳受声音刺激后无明显变化，则为最小放声声压的听觉阈值。

1.2.3 ABR测定方法 首先，对试验鱼进行麻醉，在试验鱼背鳍基部注射浓度为4 μg/g(体质量)的加拉碘铵(Sigma，G8134)肌肉松弛剂溶液，以防止肌肉运动所产生的噪声干扰。1～2 min后，鱼体仅能鳃盖做轻微运动，躯干部无大幅度肌肉收缩，麻醉可持续为6～8 h。

取直径为0.3 mm的两根红黑钢电极(NE-S-1000/13/0.4，西安富德公司)，针长13 mm，直径0.4 mm。红色记录电极(recording electrode)，从试验鱼头骨中缝听神经上方刺入，黑色参考电极(reference electrode)从试验鱼听神经后方肌肉处刺入，电极线暴露部分长度均控制在2.0～3.0 mm，用于采集脑干反应信号[30]。鱼体用聚乙烯网片包裹固定，而后将试验鱼使用“L”形支架固定放置于水槽内，电极线通过前置放大器与TDT相连。试验过程中，利用SigGenRZ软件放声，分别在频率为100、200、300、500、800、1000、1500、2000 Hz时，采用短纯音对试验鱼进行听觉阈值测定，测定时在8个频率中以声压级5 dB递减方式减小放声，接近阈值时，以2 dB递减，通过TDT系统观测试验鱼的ABR波形图像变化进而判断鱼的听觉阈值，直至观测到无法确定可识别和可重复的波形，则为最小放声声压的听觉阈值。试验过程全程中进行环境噪声监测。

1.3 数据处理

使用SPSS 20软件对试验数据进行统计处理，试验数据用平均值±标准差(mean±S.D.)表示。

2 结果与分析

2.1 ECG图像

2.1.1 驯化前 从暂养池中随机挑选鲫1尾，利用单电极导出法将采集到的图像传输到心电图机，而后导入示波器中呈现，通过图像采集的稳定与否判断是否用作试验鱼。图3为未刺激时试验鱼的心电图图像，在20 s的时间段中出现16个心率周期，每个周期为(1.250±0.034)s，可判断试验鱼的心跳约为48 次/min。

2.1.2 驯化时 图4为试验鱼在进行声电刺激时的心电图图像，在声电刺激的作用下，试验鱼心跳会出现骤停现象，经过短暂恢复后，试验鱼心跳逐渐恢复，其中恢复的时间会随着电击次数的增加而减短，如图5所示。在第1次电击时，心跳恢复周期为(8.200±0.095) s，随着次数的增加逐次递减，到第7次电击时，心跳恢复周期为(4.970±0.067) s。试验鱼随着电击次数的增加，对电击的适应性逐渐增强。

图3 无刺激时试验鱼的心电图图像Fig.3 ECG waveforms of crucian carp Carassius auratus Linnaeus without electrical stimulation

图4 声电刺激时试验鱼的心电图信号Fig.4 ECG waveforms of crucian carp Carassius auratus Linnaeus exposed to electrical stimulation

图5 试验鱼心率恢复周期随电击次数的变化Fig.5 Changes in heartbeat recovery cycle with electric shock times in crucian carp Carassius auratus Linnaeus

2.1.3 驯化后 试验鱼在建立条件反射后，对声音刺激产生了记忆，在感受到声音刺激后产生心率周期的变化，其心搏速率将自动放缓，以此预防随之而来的电击。试验鱼在受到刺激时心跳减慢，波形中两波峰间的间距明显变大，心率周期延长。如图6所示，声刺激(无电)时播放纯音信号为1～2 s，试验鱼心跳发生变化明显，心率周期明显延长，表明试验鱼受到刺激。试验鱼受到声刺激(无电)后，心律周期均发生明显变化，如图7所示，可以清晰地看出心率周期从反应前的(1.250±0.034) s，延长至反应后的(2.840±0.149) s。通过心电图的变化，可判断试验鱼是否受到了声刺激。

图6 受声音(无电)刺激后试验鱼的心电图图像Fig.6 ECG waveforms of crucian carp Carassius auratus Linnaeus during reaction process

图7 试验鱼未反应时心率周期与对刺激反应时心率周期Fig.7 Eccentricity cycles of crucian carp Carassius auratus Linnaeus with and without response

2.2 ABR图像

本试验中所用20尾鲫均测得ABR波形。整个试验的ABR波形包括7～11个正向波峰，最大振幅出现在中间部分，波形的潜伏期与刺激声音声压级变化有关。在同一频率下，潜伏期随声压级从高强度到低强度逐渐延长，即声压级越高潜伏期越短。鲫ABR波形的幅值，也随着声压级降低而逐渐减弱。例如，在500 Hz刺激声音条件下(图8)，在重复1000次的基础上，声压级为110 dB时鲫ABR波形的振幅值最大；将声压级继续降低到80 dB时，鲫ABR波形的振幅值最小；继续衰减声压级时，则无法继续获得ABR波形。因此，认为500 Hz条件下鲫的听觉阈值为(80.0±0.9)dB。

图8 500 Hz声刺激条件下鲫听觉脑干反应波形图(1000次重复平均)Fig.8 Waveforms of ABR response of crucian carp Carassius auratus Linnaeus in 500 Hz acoustic stimulus (average of 1000 different waveforms)

2.3 鲫听力图

根据ECG法和ABR法所测鲫的听觉阈值，绘制出鲫的听觉敏感曲线(图9)，用两种方法测得鲫的听觉敏感曲线整体均呈现出“W” 型趋势，即在不同频率段上鲫有多个敏感频率，符合骨鳔鱼类广域频率的听觉特征。ECG法中，100～200 Hz频率范围内，鲫的听觉阈值为(98.00±0.84)～(115.00±0.72)dB，听觉阈值较高敏感性差；在300～800 Hz频率段，鲫的听觉阈值呈现波动下降趋势，最敏感频率出现在800 Hz，对应的听觉阈值最小，为(70.00±0.55)dB；而后在800 Hz以上频率段，听觉阈值随着频率的增加而变大。

图9 心电图法和听觉脑干反应法测得的鲫听觉阈值Fig.9 Audibility thresholds of crucian carp Carassius auratus Linnaeus measured by electrocardiogram and auditory brainstem response

ABR法中，听觉阈值随频率增加而改变的趋势与ECG法基本相似，最敏感频率也为800 Hz，听觉阈值为(76.00±0.50)dB。总体上，用ABR法所测听觉阈值略高于ECG法，但两者在统计学上无显著性差异(P>0.05)。

3 讨论

3.1 ECG法和ABR法的优缺点

在信号采集方面，ECG法需提前掌握心脏在鱼体中的位置，以保证电极采集部分与心脏壁精准贴合，属一种体内侵入型试验方法；而ABR法属非体内侵入型试验方法，仅需掌握鱼类头骨中缝的听觉神经位置，适用范围较广[19]，对于鲫等纺锤形鱼类来说，用ABR法采集信号过程更为简便。在试验中，ECG法需对试验鱼进行声电刺激驯化，以使其对声音形成记忆力，驯化过程繁琐，而ABR法则不需要驯化[26]。

在结果测定方面，ECG法需人为反复测量心电图中心跳间隔变化，直至观测到心跳受声音刺激后无明显波动，则为最小放声声压的听觉阈值；而ABR法可通过计算机软件实现上千次的平均，直至观测到无法确定可识别和可重复的波形，则为最小放声声压的听觉阈值[26]，此法操作简便，数据精准，但易受仪器性能和试验环境影响，以及主观因素所影响，即不同的实验室所测的结果可能不同。

本试验在两种方法的对比中，100～200 Hz频率范围内，ECG法所测鲫听觉阈值小于ABR法，主要原因是ABR法是听觉脑干区域对声压刺激的反射，而ECG法是全身听觉器官对声音刺激的反射，包括侧线对粒子振动的感知。这与Kenyon等[19]和Kojima等[26]认为ABR法在频率低于100 Hz时测量不精准的观点相一致。Ladich等[25]使用ABR法和行为法，比较了金鱼Carassiusauratus的听觉敏感度曲线，并指出在相同条件下，鱼类对声音的行为反应阈值比实验室内采用ABR法所测的听觉阈值低。这是因为水粒子振动也是影响鱼类听觉的重要因素，ABR法仅仅是监测鱼类对声压的敏感度。Slabbekoorn等[31]在研究鱼类听觉阈值时建议，在相同声音背景条件下，可以使用两种或两种以上方法进行鱼类听觉阈值测量。因此，本试验中使用ECG法和ABR法两种试验方法对鲫进行听觉阈值测量，试验结果科学可信。

3.2 ECG法和ABR法测量结果比较

不同的试验方法所测得的鱼类听觉阈值可能不同。Kojima等[26]针对鲤和金鱼通过ECG法和ABR法进行比较。在低于1000 Hz频率段内，鲤用ABR法所测听觉阈值低于ECG法，金鱼则相反，ECG法相对较低；而在1000 Hz以上频率段，鲤和金鱼总体上ABR阈值低于ECG法。

这可能源于环境噪声的掩蔽，或试验装置在水缸中的粒子运动的效果所造成的影响，甚至在相同的试验中，相同频率也可能导致阈值的变化。另外，ECG试验中使用的麻醉剂量及电击伏数所造成的影响，也可能引起心电图阈值间的变化。而且在低频率中，ECG法获得的阈值可能会受侧线对粒子振动灵敏度的影响(如大西洋鳕在100 Hz下敏感，马苏大麻哈鱼在100～200 Hz下敏感)，以及受水槽中扬声器产生的水粒子振动不均等[4,19]的影响，ABR检测同步的神经活动是在第八颅神经和在颅骨表面脑干听觉神经核，ABR记录内耳声压反应，它不能代表由水平线检测到的近场粒子运动的影响。另外，仪器设备交流电的低频声和环境噪声对脑干反应也会产生影响。

本试验中，用ECG和ABR两种试验方法测得的听觉阈值结果总体上相差为(3.50±0.75)dB且无显著性差异。因此，今后在研究鱼类听觉阈值时，应当考虑这两种试验方法对结果的影响。

4 结语

本试验中采用ECG法和ABR法对鲫的听觉特性进行了测定。结果表明：用ECG法测得的敏感频率范围为300～1000 Hz，最敏感频率为800 Hz，对应听觉阈值为(70.00±0.55)dB；频率范围方面ABR法与ECG法相近，最敏感频率相同，听觉阈值方面ABR法略高，为(76.00±0.50) dB。对比两种方法的利弊，ABR法较ECG法操作简便，但对环境要求较ECG法更高。对于养殖鱼类来说，如果其生存环境中遭到环境噪声的污染，其产量和品质均会受到较大影响。为提高淡水捕捞效率，保护淡水生态环境，淡水牧场的建立已成为重要的解决手段之一，其中关键技术——音响驯化技术，需要具备完整的声频参数，以使效果达到最佳。鲫作为淡水牧场中重要的驯化品种之一，了解其听觉特性是十分必要的。本试验结果可为淡水养殖业中推广声诱集投饵、声诱集捕捞等方面提供科学参考和数据支持。然而在此次试验过程中，虽然有隔音设备来屏蔽噪音，但仍有部分噪声及电源信号杂波等对结果产生影响；其次，在麻醉鱼用药剂量方面还有待探索；与此同时，还应在听觉敏感频率范围间开展更为细化的测定与研究。由于实验室内与实际水域有一定的差距，因此，在今后进行鱼类听觉阈值研究中，还应当加强试验鱼的野外测定。