杜雯,王中伟，孟凡冰,，李云成,*，刘达玉,，余华，彭镰心

(1.成都大学 药学与生物工程学院，成都 610106；2.农业农村部杂粮加工重点实验室，成都 610106)

酱油是一种以大豆、小麦或麸皮为原料酿造的一种具有独特酱香且营养丰富的调味品。酱油的酿造工艺主要分为低盐固态发酵法和高盐稀态发酵法两种[1]。在酱油的发酵成熟过程中，蛋白质、淀粉等的简单分解及有机成分间复杂的酶解与合成过程，产生大量的小分子化合物，构成酱油的风味[2]。除此之外，风味物质的产生还与酱醪中的微生物活动息息相关，酵母菌直接或间接地参与了酱油中的酒精发酵、酸类发酵和酯化作用等[3]，通过代谢组学对低分子量代谢产物的综合研究发现，这些反应既可减少酱油中的一些不良风味，又可促进酱油风味更加丰富和柔和[4]。此外，某些酵母菌的发酵作用对4-乙基愈创木酚(4-EG)、4-乙基苯酚、2-乙基-4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮(HEMF)等酱油特征性风味物质的积累有重要影响[5]。然而，酵母菌在酱油高盐酿造过程中生长缓慢或不能生长，因此能够选育出高耐受性(耐盐、耐温、耐酸)的酵母菌株对酱油品质的提高有重要意义。

1 酱油酿造产香酵母的种类

目前，酱醅中可分离出7个属，32个种的酵母菌，工业上用于酱油发酵的酵母菌主要包括作为主发酵酵母的鲁氏酵母和赋予酱油特定香气成分的球拟酵母(也称后发酵酵母)，也有部分假丝酵母可作为后发酵酵母运用于酱油生产中[6,7]。

1.1 鲁氏酵母

鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)具有良好的耐盐性能，在18%食盐浓度下仍能生长，在24%食盐浓度下生长弱，向酱醪中添加VB5、VB7、肌醇、胆碱能够促进鲁氏酵母在高食盐浓度下生长[8]。在高盐稀态酱油发酵中鲁氏酵母作为主发酵酵母进行酒精发酵作用，通过糖酵解途径(EMP途径)生成乙醇，也可同酿酒酵母一样通过埃利希途径利用不同支链氨基酸合成相对应的芳香杂醇如异戊醇、活性戊醇、异丁醇等[9]。郭建等[10]接种鲁氏酵母CICC1417后能显著提高酱醪中的HEMF含量。Meng等[11]研究表明，鲁氏酵母发酵能够产生2-呋喃甲硫醇和2-巯基丙酸乙酯，其对日系酱油的风味有着重要作用。另外，随着发酵温度的升高，鲁氏酵母自溶促进了后熟酵母如易变圆酵母、多变假丝酵母、球拟酵母等的生长代谢，产生4-EG、4-乙基酚、HEMF等香味物质[12,13]。

1.2 球拟酵母

球拟酵母也是一种在高渗透压下仍能生长的耐盐性酵母，属于后发酵酵母，起产酯增香的作用，主要形成4-乙基苯酚(4-EP)、4-EG和2-苯乙醇等香气成分，同时酵母菌体在发酵后期发生自溶，呈鲜味的核酸类物质的含量增加[14]。在酱油中添加球拟酵母可相对缩短生产周期，有效提高酱油品质。球拟酵母还可产生酸性蛋白酶，在发酵后期对未分解的肽链进一步水解，提高酱油的鲜味。酱油发酵常用的球拟酵母主要有三类：易变球拟酵母(Torulopsisversatilis)、埃契氏球拟酵母(Torulopsisetchellsii)和蒙奇球拟酵母(Torulopsismogii)[15]。郦平尔等[16]在采用泸酿2.14球拟酵母改善低盐固态淋浇发酵的酱油品质实验中，得出最佳发酵工艺参数是在发酵21 d时添加1.4%的球拟酵母，并调节发酵温度至32 ℃，其酱油氨基酸态氮含量平均值为1.43 g/dL，与预测值(1.44 g/dL)偏差小于2%，具有较好的实践指导意义。

1.3 假丝酵母

假丝酵母(Candidaversatilis)是一类发酵能力较弱的酵母，有氧条件下能够生长繁殖，无氧条件下能够发酵乙醇。假丝酵母自身能够合成甘油，同时还能从环境中吸收甘油，因此具有很高的耐盐性，在高盐条件下能发酵麦芽糖生成乙醇，同时还能产生酚类化合物，如赋予酱油丁香香味和烟熏味的4-EG和4-乙基酚等。曹小红等[17]研究耐盐酵母添加对高盐稀态酱醪风味成分的影响时表明，在酱醪发酵第45天时添加假丝酵母可以提高酱油中主要酯类、醇类及醛类的含量且HEMF的含量也可明显提高。Feng等采用两步酱油接种法向高盐稀态酱油中接种假丝酵母，可有效提高酱油的氨基酸态氮、无盐固形物及挥发性风味成分。

2 酱油酿造产香酵母的选育技术

目前存在的天然酵母抗逆性差，耐盐、耐酸、耐高温性能差，因此需要通过选育得到性状稳定、耐性较好的菌株。食品微生物育种的方式主要有诱变育种、基因组重排等；近年来，原生质体融合技术也在不断发展，逐渐得到广泛应用；进化工程选育作为一种新兴的选育技术也在逐步应用于微生物的选育中。

2.1 诱变育种

诱变育种是指运用物理或化学的方式，诱导微生物的遗传特性发生变异，再从变异的群体中选择符合人们某种要求的单株菌体，进而培育成为新的品种的育种方式。诱变育种具有操作简单、易重复、操作过程不会引入外源基因等优势，保证了食品的安全性，因而广泛应用于食品微生物的选育中[18]。

物理诱变利用紫外线、X射线、α射线、β射线、γ射线、激光、微波、离子注入等物理方式提高生物的自然突变率。其中，紫外诱变因其危险性低、设备简单成为实验室最常用的物理诱变手段。化学诱变是利用一些化学诱变剂(烷化剂、碱基类似物、嵌入剂、某些无机化合物等)来提高生物的自然突变率的育种方式。常用的烷化剂有甲基磺酸乙酯(EMS)和亚硝基胍(NTG)；常用的碱基类似物有6-嗅尿嘧啶、马来酰肼、2-氨基嘌呤等；常用的嵌入剂有溴化乙锭(EB)，可嵌入碱基分子中导致错配；常用的无机化合物主要有氯化锂、亚硝酸盐、过氧化氢等[19]。Tekarslansahin等[20]通过EMS诱变获得耐盐酿酒酵母菌株，盐浓度最高可达8.5%。有时单一的突变方式并不能得到我们想要的性状，宋茜[21]将经过紫外照射与EMS诱变处理后高盐平板筛选得到的突变群体作为出发菌株，结合基因组重排和高盐培养基筛选，得到的菌株H3-8耐盐性由12%提高到20%，并且大量产生乙醇、乙酸乙酯等风味物质。

总的来说,诱变育种在操作上方便，对设备要求低，可行性高，但是存在变异方向不受控等缺陷，因此提高诱变效率，迅速鉴定和筛选突变体以及探索定向诱变的途径，是当前研究的重要课题。

2.2 原生质体融合

原生质体融合，又称为细胞融合，指通过人为的方法将两个或两个以上遗传性状不同的细胞原生质体进行接触，使得发生细胞质和细胞膜融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的方法[22]。原生质体融合的过程一般分为原生质体的形成、原生质体的融合、原生质体的再生与选择3个阶段。Lee等[23]在3.0%的EMS中通过营养补充的方法筛选出鲁氏酵母ZRM-83和酿酒酵母SCM-46的营养缺陷性突变型菌株鲁氏酵母M-12和酿酒酵母M-43，发现在0.05 mg/mL的消解酶中培养60 min后，两个两种菌株的原生质体融合效果更好，用20%聚乙二醇6000处理30 min后融合效率和融合频率均显著提高，且这些来源于两种原生质体的融合子具有细胞大、DNA含量高的特性。

相对于常规的诱变育种，原生质体融合技术用于微生物育种的目的性强，成功的机率较大，单亲灭活原生质体融合法大大提高了筛选的效率。由于它所具有的受接合型的限制较小、遗传物质更加完整、杂交频率高等一系列特点，原生质体融合技术越来越被国内外酵母选育专家和其他微生物育种学者广泛研究和应用。

2.3 Genome Shuffling技术

基因组重排首先通过传统诱变方法对性状优良的出发菌株进行诱变，通过诱变来筛选不同优良正突变的菌株建立突变体库，然后将这些突变体的基因通过原生质体融合技术发生随机重组融合，经过多轮递推原生质体融合，众多优良性状的基因就可以集中在同一菌株，因此可高效率、快速地筛选到性状得到较大提升的融合菌株[24]。王春玲等[25]通过基因组改组从酿酒酵母AS21182中获得的S3-4菌株耐盐性从100 g/L提高到180 g/L，且乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙醇和乙酸等物质的含量均得到有效提高。Cao等[26]经过三轮基因组重组，从酱油鲁氏酵母中筛选出一株抗盐性较强的突变体S3-2，此突变体加速了酱油风味的形成时间，经检测，乙酸乙酯含量是对照组的2.38倍，HEMF含量提高了75%，基因组重组法成功改善酱油风味。Cao等[27]也对异常汉逊氏酵母(Hansenulaanomala)中一株耐盐性较强的突变株H3-8进行了三轮基因组重组筛选，结果表明H3-8可以在含盐量17%的YPD培养基中生长，且能在较宽的pH范围内生长，此外，H3-8中的HEMF产量是鲁氏酵母的6.3倍，由H3-8生产的乙酸乙酯是易变球拟酵母的734倍。4-EG的产量比易变球拟酵母的增加了10.84%。

经基因组重排改造后的酵母菌株可有效提高产物产量以及对环境的耐受性，改善底物的利用率和范围，产生新的代谢产物或提高酵母遗传多样性，且可稳定遗传。在未来，基因组重排将会推动酵母菌株育种工程的发展，优良性状的酵母菌种将会在食品酿造领域获得广泛的应用前景。

2.4 进化工程选育

进化工程(evolutional engineering)是为了获得某个既定表型菌株，在人工提供选择压力的条件下通过模拟自然进化中的生物变异和选择过程使微生物进化，然后从进化的菌群中筛选出性状优良的菌株的方法[28]。目前进化工程在工业酵母的选育上研究较多，研究者不仅能够通过进化工程得到性能有所提高的表现型菌株，同时在关键酶作用和代谢途径的研究方面取得了一定的进展[29]。利用酱油酿造的环境压力(如食盐浓度、pH、温度等)加速目标菌株产生适应性进化，大大提高了菌株的抗逆性，因此其在耐盐性、耐酸性和耐温性产香酵母的选育方面具有很好的应用前景。冯杰采用批次驯化的方法将埃切假丝酵母的耐盐浓度从180 g/L提高到240 g/L，且能明显提高酱油中HEMF、4-羟基-2,5-二甲基-3-呋喃酮(HDMF)和4-EG等关键风味化合物质含量，显著改善酱油的风味品质。在菌种选育过程中，进化工程还可以与诱变育种相结合，通过诱变产生大量的突变文库，然后利用外加压力进行选择性筛选，把负向突变或目标性状较弱的突变体加以淘汰，增加正向突变的筛选成功率[30]。然而，目前关于产香酵母的进化工程选育的研究报道还很少，但相信未来该方法会在酱油产香酵母选育领域加以利用。

3 小结与展望

总的来说，近年来有关酱油产香酵母菌的选育研究越来越受到重视。目前产香酵母的选育多采用诱变育种的方式来进行特定性状菌株的选育，虽然此方法对设备要求低、方便、易操作，但是突变方向往往不确定，因此需要利用更好的技术来实现菌株性能的定向改变。原生质体融合、基因组重排以及进化工程的方法在工业酿酒酵母的选育中有着较为广泛的应用，但是在酱油发酵产香酵母的选育研究中还相对较少，技术尚不成熟。因此，在今后的研究中可加大技术开发力度，通过这些技术实现产香酵母中香味物质的大量积累。同时，还需加大基础研究，深入探究产香酵母风味物质的产生机理，为实现产香酵母合理代谢工程(rational engineering)改造奠定基础。