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加味凉血消风散对寻常型银屑病血热证JAK3/STAT3通路BCL-2、P53蛋白水平影响

2019-01-10胡霞谭红雁谭雯郝平生

云南中医中药杂志 2019年12期
关键词:凉血批号银屑病

胡霞 谭红雁 谭雯 郝平生

摘要:目的 分析加味凉血消风散对Janus激酶信号转导子与转录激活子(The Janus kinase/signal transducer and activator of tran-scriptions,JAK/STAT)通路中凋亡相關因子蛋白水平的影响,探究凋亡特征和作用微观机制。方法 Western Blot检测实验组治疗前后和对照组血清中JAK3、STAT3、BCL-2、P53表达水平。结果 实验组治疗前与对照组比:JAK3、STAT3、BCL-2偏高而P53偏低(P<0.01);实验组治疗后与治疗前比:P53上升而JAK3、STAT3、BCL-2下降(P<0.05)。结论 JAK3/STAT3信号通路活化、细胞凋亡受抑可能是发病机制之一;加味凉血消风散可能通过下调JAK3/STAT3通路活化调节P53、BCL-2蛋白水平,促进细胞凋亡,达到治疗血热证寻常型银屑病的目的。

关键词:寻常型银屑病;JAK3/STA3信号通路;BCL-2;P53;加味凉血消风散

中图分类号:R758.63  文献标志码:A  文章编号:1007-2349(2019)12-0022-06

【Abstract】Objective: To analyze the effect of modified Liangxue Xiaofeng Powder on the levels of apoptosis-related factor proteins in Janus kinase signal transducer and activator of tran-scriptions (JAK/STAT) pathway and explore the microscopic mechanisms of apoptotic features and effects. Methods: Western Blot was used to detect the expression levels of JAK3, STAT3, BCL-2 and P53 in the serum of the experimental group before and after treatment. Results: Compared with those of the control group before treatment, JAK3, STAT3, BCL-2 of the experiment group were higher and P53 was lower (P<0.01). The experimental group was compared with that before treatment, P53 increased and JAK3, STAT3, BCL-2 decreased (P<0.05). Conclusion: The activation of JAK3/STAT3 signaling pathway and the inhibition of apoptosis may be one of pathogenesis. Modified Liangxie Xiaofeng Powder may regulate P53 and BCL-2 protein levels and promote apoptosis by down-regulating JAK3/STAT3 pathway activation in order to achieve the purpose of treating blood heat syndrome of psoriasis vulgaris.

【Key words】psoriasis vulgaris, JAK3/STA3 signaling pathway, BCL-2, P53, modified Liangxue Xiaofeng Powder

银屑病是一种多基因遗传的慢性炎症性皮肤病,以红斑鳞屑为主要表现,临床以寻常型多见,占97.9%[1]。病机不明确,诱因众多,使该病具难治愈易复发的特点,明确其发病机制,探讨临床起效微观机制,一直是该邻域研究热点。银屑病发病原因不详,但病理改变确切,主要病理改变表现为角质形成细胞(Keratinocyte,KC)过度增殖和分化不全,近年研究又发现KC细胞凋亡与银屑病发病密切相关,细胞凋亡的增加可能是为改善过度增殖,而JAK/STAT通路作为介导细胞因子信号内传的通路,参与银屑病形成,在KC增殖、凋亡、免疫调节等多方面发挥作用。临床研究已证实加味凉血消风散对血热证寻常型银屑病有较好的疗效[2],前期研究证实其有抗炎、抑制KC角化、抑制增殖细胞核抗原及调控TNFR1等作用[3-4]。但该中药复方辨治血热证的微观物质基础与影响JAK/STAT通路及细胞凋亡之间的关系尚未明确,故笔者进一步检测加味凉血消风散治疗寻常型银屑病血热证前后血清中P53、BCL-2凋亡因子及JAK3、STAT3信号因子蛋白表达情况,与对照组比较,分析KC细胞凋亡及JAK/STAT通路在寻常型银屑病中作用,探讨加味凉血消风散对细胞凋亡和JAK/STAT信号通路的影响,总结加味凉血消风散治疗寻常型银屑病血热证的部分微观机制。本研究已获得四川中医药区域伦理审查委员会的批准书及受试者签署的知情同意书。

1 材料与方法

1.1 临床资料 符合寻常型银屑病血热证纳入标准的患者10例作为实验组,来源于2016年6月-2017年6月四川省中医院皮肤科门诊患者,男女各5例,平均年龄(40.20±12.53)岁,病程6月-20年,平均病程(97.20±87.67)月,病情及严重程度指数(PASI)评分为(16.20±3.90)。临床健康志愿者10例作为对照组,来源于成都中医药大学学生及健康体检者,其中男4例,女6例,平均年龄(31.40±5.17)岁。2组比较,差异无统计学意义(P>0.05),具可比性。

1.2 诊断标准 寻常型银屑病西医诊断标准据张学军主编《皮肤性病学》制定[5],血热证中医诊断标准据欧阳恒主编《新编中医皮肤病学》及2002 年版《中药新藥临床研究指导原则》[6-7]制定。

1.3 纳入标准 实验组:①符合寻常型银屑病诊断标准及血热证辨证要求;②签署知情同意书时年龄18岁-70岁;③未合并其他皮肤病;④无心、脑、肝、肾系统等严重原发疾病,慢性消耗性疾病及精神疾病;⑤近1个月内未接受系统糖皮质激素、维甲酸类和免疫抑制剂治。对照组:①签署知情同意书时年龄18岁-65 岁;②无银屑病家族遗传史;③无严重系统性疾病、肿瘤、免疫缺陷或精神障碍者;④近1个月内未使用激素或免疫抑制剂等。

1.4 排除标准 实验组:①不符合诊断标准和纳入标准;②虽符合诊断标准,但有下列情况之一者:属脓疱型、红皮病型、关节型及混合型银屑病者;不能签署知情同意书者;孕妇等不符合伦理学要求者。对照组:不能签署知情同意书。

1.5 剔除标准 ①对本研究所用药物过敏者;②治疗过程中,未按要求服药,或自行服用其他药物,不能判定疗效者;③不配合复查、采集血样等实验操作的不合作者;④记录不全或自动中止治疗者;⑤干预过程中出现重大负面事件,如伤病、重大精神刺激者。

1.6 药物及试剂 加味凉血消风散免煎颗粒,四川省中医院药剂科制备;BCA蛋白浓度测定试剂盒,批号:KGP903,南京凯基生物公司;预染蛋白 Marker,批号:00215343,美国 NEB 公司;ECL 发光试剂盒,批号:BL520A,美国 Thermo 公司;PVDF 膜,美国 Hybond 公司;BCL2 抗体,兔单克隆抗体,批号:ab32124;JAK3 抗体,兔多克隆抗体,批号:ab203611;P53 抗体,兔多克隆抗体,批号:ab31333;STAT3 抗体,兔单克隆抗体,批号:ab32500;β-actin 抗体,鼠单克隆抗体,批号:ab8226;生物素化山羊抗鼠 IgG(H+L),批号:ab6789;生物素化山羊抗兔 IgG(H+L),批号:ab6721,均购于英国 abcam--艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.7 仪器 垂直电泳槽、DYY-6C 电泳仪、UVTransilluminator化学发光凝胶成像仪、ChemiDoc XRS+ Systems 凝胶扫描成像仪、Image Lab 凝胶分析系统,均购于美国 Bio-RAD 公司;TS-2 水平脱色摇床,海门Kylin-Bell仪器制造有限公司;Thermo 全功能酶标仪,型号:MK3,美国ThermoFisher 仪器有限公司;MDF-U50V 型超低温冰箱,日本 Sanyo 公司;TGL-16 g-A 型高速低温离心机,上海安亭科学仪器厂。

1.8 治疗方法及疗效判定 治疗组口服中药免煎剂:加味凉血消风散颗粒,组成:水牛角粉30 g,生地20 g,丹皮15 g,连翘15、僵蚕10 g,地骨皮15 g,紫荆皮15 g,冬桑叶5 g,炙甘草3 g,白花蛇舌草30 g,玄参15 g,女贞子15 g,旱莲草20 g。每日早、中、晚3次,每次1小格,开水冲服。治疗周期为8周,每2周复诊一次,治疗期间不服用及外用其他药物,皮肤干燥可予白凡士林外用缓解。治疗前后按照PASI 评分法及样本蛋白指标变化评估临床疗效;治疗前后检查患者血常规、肝肾功能评估安全性。

1.8.1 样本采集 无菌采集对照组及实验组治疗前后清晨空腹外周静脉血5 mL,置于抗凝管中。

1.8.2 检测指标 Western blot法检测血清中JAK3、STAT3、BCL-2、P53的蛋白水平

实验步骤:①提取细胞总蛋白并定量:将新鲜外周血离心分离白细胞,加入RIPA裂解液,冰上裂解10 min后离心10 min取上清液;按BCA蛋白定量试剂盒方法进行蛋白定量,绘制标准蛋白曲线,测定样品蛋白浓度;②SDS-PAGE电泳:放入备好积层胶,加电泳缓冲液后上样,第1个样孔中加入5 uL的预染蛋白Marker,据所测蛋白浓度,每孔按蛋白量60 ug上样,稳定电压为100 V,15 min,当溴酚兰染料到分离胶便将电压调至180 V继续电泳,达凝胶底部时终  止;③转膜:卸下分离胶,标记方位,照分离胶尺寸剪1张PVDF膜和6张滤纸,依次以海绵、滤纸(3张)、膜、分离胶、滤纸(3张)、海绵的顺序叠放,200 mA转膜1-2 h;④封闭、抗体孵育:将PVDF膜放入5%BSA封闭液,摇床轻摇2 h,TBST洗膜3次;一抗孵育:加入BCL2、JAK3、P53、STAT3和β-actin一抗4℃过夜,TBST洗膜3次;二抗孵育:加入二抗,室温轻摇2-3 h,TBST洗膜3次;⑤显影、图像分析:将ECL发光液均匀滴加到膜上,反应1 min后去尽残液,放入化学发光凝胶成像仪的暗室中曝光显影;将胶片用Image Lab 凝胶分析系统进行扫描分析,结果以目的蛋白相对表达量表示。目的蛋白相对表达量=目的蛋白积分光密度值(IOD)/内参积分光密度值(IOD)。

1.9 统计方法 使用SPSS 17.0进行统计分析。数据以Mean±SD表示,多样本均数间比较采用One-Way ANOVA检验,方差齐则采用LSD检验,方差不齐则采用Tamhanes T2检验,检验结果以P<0.05时认为其组间差异有显著性。

2 结果

2.1 治疗前后PASI评分比较及安全性评价 实验组治疗前PASI评分为16.20±3.90,治疗后为7.03±2.62,PASI评分较前明显下降,t=6.004,P<0.01。治疗前后血常规、肝肾功能未见异常,且未有其他不良事件发生。

2.2 蛋白水平

2.2.1 各组蛋白电泳条带清晰,实验组与对照组灰度之间有差异 见图1-图5。

2.2.2 各组目的蛋白统计结果以OD值表示,见表1。

3 讨论

银屑病难治愈易复发,病因不明,病理改变确切,有学者从角质形成细胞病理改变角度来研究本病,认为表皮KC过度增殖,导致皮肤角化过度,产生银白色鳞屑[8]。笔者发现KC细胞增殖与细胞凋亡异常有关,抑制KC凋亡从而会出现银屑病表皮细胞增生的表现[9]。正常情况下,细胞凋亡平衡增殖以维持表皮厚度,有助于角质层的形成,并可消除恶性肿瘤细胞[10],而银屑病患者的这种稳态是失衡的,表现为表皮过度增殖和角化不全,角质形成细胞的分化也被看作是另一种形式的凋亡[11]。过度增殖和分化不全意味着凋亡的异常,而细胞凋亡受到诸多凋亡基因及信号通路的影响。

BCL-2、P53是一组调控细胞凋亡的重要基因且参与银屑病发病。孙军等[11]认为KC的凋亡过程可被凋亡抑制蛋白阻断,如BCL-2和IAP家族蛋白Survivin。倪晓等[12]认为BCL-2与原癌基因c-myc 的共表达则能有效地拮抗p53的G1期停滞和细胞凋亡二种作用。崔红宙等[13]认为银屑病中p53结构发生了变化,导致p53磷酸化作用减弱或消失,促进银屑病的发生。研究表明,银屑病患者外周血淋巴细胞中BCL-2蛋白表达下降、P53表达增加[14],细胞凋亡异常。

JAK3/STAT3信号通路活化与银屑病发病、细胞凋亡相关。JAK/STAT通路由JAK激酶和转录激活子STAT组成,广泛参与细胞外信号传递:淋巴细胞等分泌的细胞因子与相应受体结合活化酪氨酸激酶JAK,活化的JAK激酶催化STAT,磷酸化的STAT以二聚体的形式进入细胞核内激活或抑制下游靶基因调节元件[15],从而实现细胞信号内传。JAK3 是JAK激酶4个亚型之一,主表达于造血细胞和淋巴细胞中[16],淋巴细胞可以分泌白细胞介素如IL-6、IL-23等,与银屑病发病相关;目前JAK3靶向抑制剂托法替尼证明对银屑病有良好治疗作用,12周治疗后39.5-63.6%实验银屑病患者显示PASI评分至少降低75%[17-18]。STAT3是STAT转录激活子7个亚型之一,作为炎症免疫反应的中心调节子参与银屑病等炎症的发病发展[19]。银屑病时STAT3活化,活化的STAT3通常存在于银屑病免疫细胞和角质形成细胞中,诱导KC的增殖和异常分化[20-22],抑制STAT3活化可以促进细胞凋亡[23]。

实验组加味凉血消风散是四川省名中医艾儒棣教授治疗寻常型银屑病血热证的验方。实验发现,治疗前血热证患者血清中JAK3/STAT3信号通路有活化,BCL-2明显升高提示细胞凋亡受到抑制,与之相对的促凋亡P53表达明显降低,这与Qin JianZhong[24]等研究认为银屑病皮损区的角质形成细胞表现出凋亡抵抗、P53活性缺乏是一致的,表明KC细胞凋亡减少。经加味凉血消风散干预后,JAK3、STAT3活化水平下调,而P53上调,这与郭彬[25]等研究认为抑制JAK/STAT通路,P53表达水平明显升高是一致的。证明加味凉血消风散发挥了调控作用,结合PASI评分的改善说明这种调控是有效的治疗,且与JAK3/STAT3通路受抑制与P53的促进相关。治后BCL-2、P53与正常人表达仍有差异,猜测与银屑病复发性有关,将作为后续大样本验证的内容。

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(收稿日期:2019-09-20)

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