林业武，陈美雄，景亚军，李义凯，袁仕国

(1 海南省中医院，海口570203；2 南方医科大学中医药学院)

肌筋膜痛是一种慢性肌肉疼痛，疼痛一般以肌肉上的激痛点(又称扳机点)为中心，向周围肌肉扩散[1]。虽然目前对扳机点现象的解释不同，但均认为肌筋膜痛症状的产生起因于扳机点[2]。炎症反应是导致机体疼痛信号产生的主要原因。有研究证实，肌筋膜痛扳机点存在明显的炎症反应[3]。因此，肌筋膜痛可能与扳机点炎症反应有关。IL-6、TNF-α可通过上调环氧化酶2(COX-2)表达，使单核细胞和巨噬细胞大量合成前列腺素E2(PGE2)，从而参与机体炎性疼痛产生。传统中医艾灸治疗肌筋膜痛可明显缓解疼痛症状[4]，但其作用机制是否与扳机点组织IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等炎症因子表达变化有关尚不清楚。2016年1月～2017年12月，本研究观察了温和灸对肌筋膜痛大鼠扳机点骨骼肌病理形态的影响，并探讨其可能的作用机制，旨在为艾灸治疗肌筋膜痛提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠64只，8周龄，体质量(285.5±18.3)g，由南方医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(粤)20160041。所有大鼠分笼饲养，自由摄食、饮水，饲养环境温度22 ℃、湿度60%。本研究符合科学和动物伦理规范，并接受南方医科大学实验动物伦理委员会监督。温和灸纯艾绒艾条，北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。XR-PT-10A型动物实验跑台，上海欣软信息科技有限公司。自制打击器[5，6]，主要部分为长度50 cm的木棒，木棒顶端载有重物，木棒及重物总质量1 200 g，下端为钝头锥形，打击面积1 cm×1 cm，打击高度20 cm，动能2.352 J。BX-53型光学显微镜，日本Olympus公司；RM2235型石蜡轮转切片机，德国Leica公司；COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α多克隆抗体及相应二抗，武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物分组处理 所有大鼠适应性饲养1周，随机分为对照组24只、模型组24只、艾灸组16只。模型组与艾灸组采用打击结合离心运动的方法[5，6]建立肌筋膜痛扳机点模型。具体方法：建模前3天，将大鼠置于动物实验跑台上进行适应性平坡跑，每次15 min，每天1次；建模期共8周，每周第1天进行1次打击，打击前用10%水合氯醛0.3 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉，麻醉完全后将大鼠固定于打击器下方，将质量为1 200 g的打击器从20 cm高度自由落下，打击右下肢股内侧肌中段偏上，造成股内侧肌钝挫伤；打击次日于倾斜度为16°的动物实验跑台上进行持续性下坡跑训练，速度16 m/min，持续90 min，运动中使用声音和电刺激驱赶。艾灸组建模结束，常规饲养7天开始艾灸治疗。艾灸治疗方法：10%水合氯醛0.3 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉，麻醉完全后将大鼠固定于固定板上，点燃艾条(长20 cm，直径7 mm)并悬空置于右股内侧肌扳机点正上方20 mm，每次30 min；将温度控制仪探头置于施灸穴位皮肤，通过调节艾条与施灸穴位距离，保持施灸部位皮肤温度(46±1)℃，每天1次，连续7天。模型组建模结束，常规饲养7天，同法麻醉并固定于固定板上，但不予艾灸治疗，每天1次，连续7天。对照组正常饲养，不建模，同期同法麻醉并固定于固定板上，但不予艾灸治疗，每天1次，连续7天。

1.3 相关指标观察

1.3.1 扳机点骨骼肌组织病理形态 对照组与模型组分别于艾灸治疗前1天及治疗结束3、14天，艾灸组于艾灸治疗结束3、14天，随机选取8只，10%水合氯醛0.3 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉，麻醉完全后固定于手术台上，充分暴露右侧股内侧肌，轻轻按压打击部位，寻找紧张带或收缩结节，即扳机点。对照组如无紧张带或收缩结节，则取右下肢股内侧肌相同部位组织。以扳机点为中心，切取1 cm×1 cm×1 cm软组织块，均分为2份。取其中1份，用生理盐水漂洗2～3次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 μm厚切片，常规HE染色，光镜下观察扳机点骨骼肌组织组织病理形态。

1.3.2 扳机点骨骼肌组织COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α表达 采用免疫组化法。取另1份扳机点组织，同法制成4 μm厚切片。切片经脱蜡、水化，3% H2O2室温孵育10 min，阻断内源性过氧化酶活性；0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 7.4)热抗原修复，自然冷却至室温。5% BSA封闭30 min，分别滴加兔抗大鼠COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α多克隆抗体(稀释比均为1∶200)，37 ℃孵育2 h；PBS冲洗5 min×3次，滴加山羊抗兔IgG二抗(稀释比1∶100)，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗5 min×3次，滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗5 min×4次，DAB显色15 min，蒸馏水冲洗，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察。COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α阳性染色区域呈棕黄色，阴性染色区域呈浅灰色。每张切片采用CellSens-Entry1.15软件随机采集5个200倍视野，Image Pro Plus6.0图像分析软件分析COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α阳性染色区域平均光密度(MOD)值。以其MOD值作为COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相对表达量[6]。

2 结果

2.1 各组扳机点骨骼肌组织病理形态变化 光镜下可见，对照组各时期扳机点肌纤维排列规则，肌间隙均匀一致，无肌纤维扭曲、断裂、溶解和坏死现象，偶有炎症细胞浸润。模型组各时期扳机点肌纤维排列紊乱、断裂、扭曲，艾灸治疗前1天扳机点局部骨骼肌有溶解坏死灶；艾灸治疗结束3天扳机点局部肌纤维纤维化增粗、肌间隙大小不一，并有大量炎性细胞浸润；艾灸治疗结束14天扳机点局部肌纤维扭曲形成结节，炎性细胞浸润较艾灸治疗结束3天明显减少。艾灸组艾灸治疗结束3天扳机点肌纤维排列和炎性细胞浸润较模型组同期明显改善，局部可见新生小血管；艾灸治疗结束14天可见扳机点骨骼肌纤维排列有序，炎性细胞浸润基本消失，但局部结节膨大尚未消失。

2.2 各组扳机点骨骼肌组织COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α表达比较 见表1。

表1 各组扳机点骨骼肌组织COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α

注：与同组治疗结束3天比较，*P<0.05；与对照组同期比较，#P<0.05；与模型组同期比较，△P<0.05。

3 讨论

肌筋膜痛是一种以存在肌筋膜扳机点为特征的局部骨骼肌疼痛综合征，可严重影响患者生活质量。目前认为，肌筋膜痛症状的产生起因于扳机点，是造成牵涉痛、关节活动受限等的主要原因[2，7]。肌筋膜扳机点具有以下病理特征：①扳机点温度高于正常组织；②扳机点局部区域可出现异常神经电生理改变；③扳机点局部区域循环灌注不佳，即有缺血情形；④扳机点局部区域缺氧，氧耐量和氧适应降低；⑤扳机点神经血管活性物质和某些神经递质异常增多；⑥扳机点局部组织形态学和显微病理学改变。虽然肌筋膜痛是非致命性疾病，但可明显降低患者生活质量。目前对肌筋膜痛并无特效治疗方法，均为对症治疗，临床以非甾体类止痛药较为常见，虽可在一定程度上缓解疼痛，但长期服用胃肠道不良反应较多。近年来中医艾灸治疗肌筋膜痛取得了一定进展。温和灸是中医艾灸中最为常用的艾灸方法，具有简、便、验、廉及患者接受程度高等优点。虽然温和灸可用于治疗肌筋膜痛，但对其作用机制尚不清楚。故本研究选择中医艾灸最为代表性的温和灸作为干预方法，采用中医“以痛为腧”取穴法取扳机点作为干预部位，探讨了温和灸对肌筋膜痛大鼠扳机点骨骼肌病理形态的影响及其可能的作用机制，旨在为艾灸治疗肌筋膜痛提供科学依据。

研究发现，人体肌肉损伤后会出现IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子分泌增多[8～11]。IL-6作为一种重要的致炎因子，可刺激炎性细胞聚集、激活，并能促进炎性介质释放[12]。血清IL-6水平增加可诱导COX-2高表达，使单核细胞和巨噬细胞大量合成PGE2，从而产生广泛而持久的血管扩张和致痛作用，在痛觉过敏形成中具有重要作用。有研究报道，COX-2与扳机点局部病理特征和疼痛密切相关。正常情况下，机体内COX-2水平相对恒定，但在炎症反应过程中其水平明显升高，继而使单核细胞和巨噬细胞大量合成PGE2。TNF-α作为一种重要的促炎介质，主要由单核巨噬细胞产生，在急性炎症反应过程中发挥关键性作用[13]。IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等形成复杂的炎症因子网络，参与扳机点炎症反应过程。

本研究结果显示，模型组扳机点局部肌纤维出现扭曲、断裂、溶解和坏死灶，早期出现大量炎性细胞浸润；艾灸组经艾灸干预扳机点局部肌纤维排列紊乱明显改善，炎性细胞浸润明显减轻，尤其是在艾灸治疗结束14天，其组织病理学表现已与对照组接近，但尚未完全恢复正常。本研究还发现，模型组各时期扳机点骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相对表达量明显高于对照组同期，而艾灸组各时期扳机点骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相对表达量明显低于模型组同期；艾灸组艾灸治疗结束14天扳机点骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相对表达量明显低于治疗结束3天，而模型组与对照组组内各时期扳机点骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相对表达量变化不明显。结果表明扳机点内存在明显的炎症反应，温和灸局部干预可降低炎症因子表达，促进局部损伤肌纤维修复。

综上所述，温和灸局部干预能够促进扳机点肌纤维修复，其作用机制与降低扳机点局部炎症细胞因子募集、减轻炎症反应有关。