党参多糖的分离纯化及抗衰老作用研究

2019-01-09杨婉羚董泽令

江苏农业科学 2018年23期

张涛，杨婉羚，曹喻，董泽令，闵迅

(1.遵义医学院检验医学院，贵州遵义 563000； 2.遵义医学院附属医院检验科，贵州遵义 563003)

多糖也称聚糖，是由多种单糖如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等，通过脱水连接在一起的生物大分子[1]。研究表明，多糖是中草药的有效成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性[2]，是构成植物细胞壁的主要成分，一般采取热水煮提法获得多糖，试验操作方便，对于多糖分子的结构破坏性较小，产率较高。

党参(CodonopsispilosulaNannf.)是我国传统的中药材，且药食两用，具有抗氧化、补气补血、抗肿瘤、免疫调节等活性[3]。研究表明，党参的活性成分包括多糖、甾醇类等活性分子[4]。对党参主要成分多糖的研究自20世纪80年代就已开展，发现党参多糖具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等活性[5]，如经党参多糖处理后衰老模型小鼠的血清中丙二醛和脑中褐质含量下降明显，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性上升明显，推测党参多糖抗衰老与其清除自由基及抗脂质过氧化相关[6]。但是目前关于党参抗氧化活性方面的研究不全面，党参多糖中的主要抗氧化活性成分不完全明确，阻碍了党参多糖的结构及药理活性研究。本试验通过提取、分离纯化及体内外抗衰老活性试验，对党参多糖进行了较为系统的研究，能够促进党参多糖类抗衰老药品的开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

党参购于贵州仙龙药业有限公司；牛血清白蛋白级分V购于罗氏公司；间羟基联苯、氨基磺酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购于Sigma公司；三氟乙酸购于国药集团；D-半乳糖(D-Gal)、乙醇、苯酚、浓硫酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、乙酸钠、氯化钠和维生素C等购于北京化工厂；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒和过氧化氢酶(CAT)试剂盒购于上海索宝生物公司。昆明系小鼠购于第三军医大学。

1.2 仪器与设备

可见分光光度计(723型)购于上海光谱仪器有限公司；电子天平(ME104)购于梅特勒-托利多公司；冷冻干燥器购于北京博医康实验仪器有限公司；电热恒温水浴锅购于北京泰泽瑞达科技有限公司；兰格蠕动泵(BT01-100)购于保定兰格恒流泵有限公司；自动部分收集器(BS-100A)购于上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.3 党参多糖的制备

称取500 g党参，洗净后，先后分别于100 ℃ 8 L及 100 ℃ 6 L蒸馏水中连续煮提2次，每次煮提4 h。将提取液浓缩至约700 mL，离心后收集上清并加入4倍体积的95%乙醇进行沉淀，离心收集多糖沉淀，利用Sevag法除蛋白后冻干，即得党参多糖(CodonopsospilosulaNannf. pdysaccharide，简称CPNP)。

1.4 党参多糖的分离纯化

称取20 g的党参多糖溶于200 mL蒸馏水中，上样于DEAE-纤维素离子交换柱(8.0 cm×20 cm，Cl-型)。依次用蒸馏水(2 L)、0.1 mol/L NaCl(2 L)和0.3 mol/L NaCl(2 L)进行洗脱，流速12 mL/min，每200 mL洗脱液收集1次。采用苯酚-硫酸法检测洗脱液中的糖含量。根据糖含量的分布图，收集适当的洗脱液，经蒸馏水透析除盐后，冻干备用。

1.5 多糖的单糖组成分析

称取多糖约2 mg于水解小瓶中，加入1.0 mL 2 mol/L的三氟乙酸溶液(TFA)，于120 ℃水解5 h；将水解产物转移至蒸发皿中，加入适量的无水乙醇，蒸干，除掉三氟乙酸；用超纯水复溶蒸干的水解产物，经0.22 μm滤膜过滤后，待离子色谱分析；采用Thermo ICS-5000+配备脉冲安培检测器，离子柱为Carbo PAC PA20(3.0 mm×150 mm)。根据Liang等建立的淋洗条件进行检测，流速0.4 mL/min，柱温28 ℃[7]。

1.6 党参多糖的分子量分布分析

称取多糖约2 mg，溶于0.2 mol/L NaCl溶液，经0.22 μm滤膜过滤后，待高效凝胶渗透色谱(high performence gel permeation chromatography，简称HPGPC)分析。标准品聚糖系列，平均分子量分别为12、50、150、270、410、670 ku。以上述标准聚糖的常用对数为纵坐标，相应的保留时间为横坐标作图，绘制标准曲线。根据标准曲线及多糖的保留时间计算出多糖的分子量。采用岛津LC-20AT系列高效液相色谱仪配备示差折光检测器，分子筛柱为TSK-gel G4000PWXL(7.8 mm×300 mm)，流动相为0.2 mol/L NaCl水溶液，流速为0.5 mL/min。

1.7 体外抗衰老试验

1.7.1 对DPPH的清除能力将党参多糖的子级分溶于蒸馏水中，配成不同浓度的溶液(0～4.0 mg/mL)。取不同浓度的多糖溶液4 mL分别与1 mL DPPH溶液(0.1 mol/L)混合，避光孵育20 min。空白对照为蒸馏水，阳性对照为维生素C。DPPH清除率=(1-D多糖/D蒸馏水)×100%，其中D多糖和D蒸馏水为溶液在517 nm处的吸光度[8]。

1.8 衰老模型小鼠试验

选择体质量20～25 g雄性小鼠30只，随机分为蒸馏水空白组、衰老模型对照组、党参多糖组，每组10只。3组于皮下注射D-半乳糖(生理盐水配成5%)构建衰老模型小鼠[10]，连续40 d。党参多糖灌胃剂量为400 mg/kg，另2组灌胃同体积蒸馏水。连续灌胃30 d，末次灌胃2 h后，小鼠眼眶取血，测定血SOD和CAT的活性，结果计算按试剂盒说明进行。

2 结果与分析

2.1 党参多糖的分离纯化

利用DEAE-纤维素柱对党参多糖进行分离纯化，分别用0、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液对党参多糖进行梯度洗脱，结果发现得到党参多糖子级分多糖-1(CodonopsispilosuiaNannf. sub-polysaccharide-1，简称CPNP-1)和党参多糖子级分多糖-2(CodonopsispilosuiaNannf. sub-polysaccharide-2，简称CPNP-2)2个级分的产率分别为 30.6% 和19.8%，二者均富含糖醛酸(图1)。

2.2 党参多糖级分CPNP-1和CPNP-2的单糖组成

采用高效离子色谱法检测党参多糖各级分的单糖组成，结果发现，党参多糖的子级分CPNP-1主要含有19.8%半乳糖醛酸(galacturonic acid，简称GalA)、23.9%半乳糖(galactose，简称Gal)、22.1%阿拉伯糖(arabinoss，简称Ara)和26.7葡萄糖(glucose，简称Glc)，还含有4.6%鼠李糖(rhamnose，简称Rha)和2.9%葡萄糖醛酸(glucuronic acid，简称GlcA)。CPNP-2主要含有GalA(32.2%)、Rha(17.9%)、Gal(17.2%)和Ara(28.3%)，以及少量的Glc(2.1%)和GlcA(2.3%)；二者Rha/GalA的比例分别为0.23和0.56，均在Ⅰ型-鼠李半乳糖醛酸聚糖(rhamngalacturonan Ⅰ，简称RG-Ⅰ)型果胶的定义范围之内(0.05～1.0)[11](图2)。推测CPNP-1和CPNP-2都属于RG-Ⅰ型果胶，并且可能带有Ⅰ/Ⅱ型-阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan Ⅰ/Ⅱ，简称Ⅰ/Ⅱ-AG)侧链。

2.3 党参多糖级分CPNP-1和CPNP-2的分子量

利用高效凝胶排阻色谱联合TSK-gel G4000PWXL分子筛对DEAE-纤维素柱分级得到的CPNP-1和CPNP-2分子量进行分析。结果发现，CPNP-1和CPNP-2的分子量分别约为51、23 ku，且均一性良好，CPNP-2呈现对称且较窄的峰型(图3)。

2.4 党参多糖体外抗衰老活性

对党参多糖子级分CPNP-1和CPNP-2的DPPH清除能力进行分析，结果发现，CPNP-1和CPNP-2都具有良好的DPPH自由基和超氧负阴离子的清除能力，且活性随着2种多糖浓度的增加而增强，呈现一定的浓度依赖性。在多糖浓度为0～4mg/mL的范围内，CPNP-1的DPPH自由基和超氧负阴离子50%有效的清除浓度分别3.6、2.1 mg/mL；CPNP-2的自由基和超氧负阴离子50%有效的清除浓度分别为1.3、0.9 mg/mL。CPNP-2的DPPH自由基和超氧负阴离子的清除能力均强于CPNP-1(图4)。

2.5 衰老模型小鼠试验

通过建立衰老模型小鼠，检测血清中SOD和CAT的活性，进而分析党参多糖子级分CPNP-2的活性，结果如表1所示。与衰老模型对照组相比，CPNP-2组血清中SOD和CAT活性显著升高(P<0.01)，且与蒸馏水空白对照组差异不明显，表明党参多糖子级分CPNP-2可以缓解衰老模型小鼠血清的SOD和CAT活性下降。