顾燕妮 谢春毅

(上海中医药大学附属上海市中西医结合医院心内科，上海200082)

非特异性炎症是为防御其他有机体侵袭导致细胞损伤的一种自我防御机制。但慢性炎症反应通常是有害的，慢性炎症性疾病(Chronic inflammatory diseases，CID)往往造成社会和经济的重大损失，如动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)、代谢综合征、神经退行性病变和肿瘤等。AS是CID中主要的疾病之一[1]。此外大量研究证明，单核巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞(Dendritic cells,DCs)和中性粒细胞参与血管壁的免疫反应，细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫应答均参与AS的形成和发展[2]。

microRNA(miRNA)是长度在21～25 nt的内源性非编码RNA，广泛存在于真核生物中，是一类重要的调控蛋白质生物合成的非编码RNA。成熟的miRNA 5′端为磷酸基团，3′端为羟基，它通过RNA聚合酶Ⅱ生成较长的具有茎-环结构的转录体前体miRNA (pri-miRNA)，在体内pri-miRNA被特异性 RNase Ⅲ类核酸内切酶(Drosha酶)切割，产生约70 nt大小具有发夹状结构的RNA前体(pre-miRNA)。在细胞质中，pre-miRNA 经过 Dicer酶加工生成约22 nt双螺旋结构的双链RNA，随后指导链(Guide chain)与特定的蛋白质(Agonate)组装成miRNA诱导的静默复合体(miRNA-induced silencing complex,miRISC)，与mRNA结合从而抑制蛋白质翻译表达。miRNA在细胞增殖、发育和组织重塑中有重要作用。近年来研究显示，miRNA参与了AS病变，同样AS病变也造成了体内miRNA谱系改变，miRNA既是临床可检测的病变指标，也是今后可开发的治疗新靶点。现将近期相关研究综述如下。

1 miR-21

最新研究显示，AS的miRNA表达谱中miR-21表达显著增高[3]。miR-21在冠状动脉疾病中过度表达，与冠心病严重程度呈正相关，与斑块稳定性呈负相关[4]。Jin等[5]报道，载脂蛋白-E/miR-21(ApoE-/-miR-21-/-)双基因敲除小鼠与ApoE-/-单基因敲除小鼠相比，前者AS血管壁更容易形成泡沫细胞和巨噬细胞浸润，而miR-21高表达时具有稳定斑块的作用，可避免斑块受到免疫系统的攻击。miR-21作为促血管新生因子，调控血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)的凋亡和增殖，促进血管新生[6]；Canfrán-Duque等[7]研究显示，miR-21在巨噬细胞中表达最丰富。巨噬细胞中若缺乏miR-21可加剧AS进展，包括斑块坏死和血管炎症。miR-21表达可影响泡沫细胞形成、内质网应激诱导凋亡的敏感性和吞噬细胞清除能力。该研究从机制上阐明，巨噬细胞缺乏miR-21可以增加靶基因MKK3表达，促进诱导p38-CHOP和JNK信号。这两条通路促进了巨噬细胞凋亡和转录后ABCG1降解(一种调节巨噬细胞胆固醇流出的转运体)。脂质沉积和炎症反应是AS发生的重要触发因素，有研究表明，miR-21通过TLR4和NF-κB通路降低IL-6水平，同时升高IL-10水平，以减少LPS诱导的巨噬细胞脂质沉积，miR-21可逆转因细菌感染诱导的AS病理过程；同时有研究认为提高miR-21表达可预防和治疗心脑血管性病变[8]。上述多个研究结论似乎并不一致，说明miR-21在AS病变过程中的作用仍具有不确定性，有待深入研究。总之，大多数研究认为，miR-21主要通过对巨噬细胞、血管内皮细胞(Endothelial cells,ECs)及炎症信号通路的调节在AS中发挥抑制脂质沉积和稳定斑块等保护作用；而另一方面，miR-21作为炎症反应的标志物又可促进免疫细胞执行炎症清除功能。miR-21的差异表达可能和AS所处的不同炎症阶段有关。

2 miR-146

miR-146家族包括miR-146a和miR-146b，分别位于人类第5和第10号染色体。在EC和巨噬细胞中都有丰富的miR-146表达。miR-146a参与了包括AS和细菌感染等多种疾病的发病机制。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)水平与miR-146a的表达呈正相关，巨噬细胞中oxLDL增高，miR-146a表达也相应增加，oxLDL通过JNK与NF-κB信号通路激活巨噬细胞，而miR-146a通过降低巨噬细胞成熟过程中CD80和CD86表达，从而阻止oxLDL造成炎症反应。因此，miR-146a可能是AS的治疗新靶点[9]。Cheng等[10]研究表明，激活EC炎症信号通路会导致AS。miR-146可以抑制EC炎症。体外实验用敲低miR-146a/146b或对miR-146采用锁核苷酸 (Locked-nucleic acid,LNA)方法处理小鼠均会激活促炎信号通路 NF-κB、MAPK和其下游的转录因子，导致EC炎症发生。该研究首次发现miR-146的靶点之一是RNA结合蛋白HuR，miR-146增高能抑制HuR蛋白，减少EC一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)产生，从而阻止EC前炎症因子活化。Del Monte等[11]研究报道，造血细胞缺乏miR-146可升高血浆胆固醇水平，但并不会促进AS进展，miR-146的靶点在LDL受体(Ldlr-/-)上，给予miR-146可增加该基因敲除小鼠动脉壁脂质沉积。有国内研究团队在大鼠VSMCs体外培养中使用miR-146a干扰技术进行研究，该研究采用了基因表达谱芯片筛选miR-146a作用的靶点和信号通路。miR-146a上调了p53信号通路中的关键分子cyclin D1的基因和蛋白水平，促进了VSMCs的增殖，该研究认为miR-146a可能与AS和球囊损伤后再狭窄的发生发展有关[12]。综上所述，miR-146a 被认为是调节免疫功能的主要miRNA之一，它可负调控炎症和免疫反应，避免过度炎症发生。通过在巨噬细胞、EC、造血细胞和VSMCs中表达miR-146，均可抑制AS炎症。外源性的miR-146补充可能对AS是一个有效的免疫调节剂。

3 miR-155

有研究证明，oxLDL是引起AS病变的主要原因之一，泡沫细胞中miR-155的表达与oxLDL的剂量和时间呈正相关，同时AS患者的血浆和AS斑块中miR-155表达也是增高的。在巨噬细胞中TNF-α诱导激活的NF-κB使得miR-155表达增加，而miR-155表达增加可抑制钙调节热稳定蛋白1(Calcium-regulated heat stable protein 1,CARHSP1)负反馈下调TNF-α，从而抑制巨噬细胞炎症应答和对脂质的吞噬。因此，AS相关的泡沫细胞形成过程中，miR-155起到了调节和抑制炎症反应的作用[13]。Yan等[14]研究发现，经oxLDL处理的DCs中miR-155表达增加，miR-155通过抑制JNK信号通路减少清道夫受体A(Scavenger receptor A,SRA)表达，该研究阐明了oxLDL对DCs存在miR-155-JNK-SRA-miR-155负反馈回路。细胞自噬与AS发生发展密切相关。我国青岛大学首次报道了oxLDL诱导人脐带静脉EC自噬过程中miR-155的研究，过度表达miR-155可促进oxLDL诱导的EC自噬活性，低表达miR-155可抑制自噬，miR-155具有调节血管EC稳定性的作用[15]。另有研究报道，ApoE-/-基因敲除小鼠高脂饮食12周后，主动脉壁上miR-155表达显著增高，miR-155表达降低可抑制AS形成；而ApoE-/-和miR-155-/-双基因敲除小鼠仅表现为肥胖、脂肪细胞肥大和脂肪肝，不产生AS。这个研究结果提示，单一miRNA缺乏(miR-155)可以解释肥胖与AS病变产生的悖论，即肥胖个体伴有miR-155表达可导致AS和相关代谢紊乱；反之，缺乏miR-155表达的单纯肥胖者仅伴有脂肪肝，可不伴有AS和相关代谢紊乱等病变[16]。总之，miR-155在炎症状态下表达增高，过度表达miR-155又具有抑制SRA和炎症因子、减少泡沫细胞形成、细胞自噬以及维持EC完整等多方面作用，同时是否表达miR-155可能是鉴别代谢综合征与单纯性肥胖的生物学指标。

4 miR-126

血管EC和内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)富含miR-126，它主要调节生理性血管生成。在胚胎血管形成期，miR-126可诱导血管生成信号，促使胚胎干细胞向EPC和EC方向分化，并促进EC成熟。在成熟EC和成人EPC中，miR-126具有抑制血管生成和维持EC表型稳定性的作用，以维护血管完整性和良好血流动力学。血管损伤和缺氧时，miR-126可上调EC和EPC的活性，以修复血管和形成新的血管。因此，miR-126具有维护血管EC和抗AS特性[17]。有研究证实，与正常对照组比较，冠心病患者miR-126表达是降低的。研究认为外周血单个核细胞miR-126检测对冠心病危重程度具有良好的诊断价值，它的表达与高敏CRP、TNF-α、IL-6和ICAM-1呈负相关，与IL-10呈正相关。该研究表明miR-126与冠心病炎症细胞因子有关[18]。血管EC凋亡和自噬是AS病变的特征，采用oxLDL激发培养人脐静脉EC方法，观察miR-126在EC潜在的自噬作用。经oxLDL诱导的EC中miR-126表达显著下降，给予miR-126模拟物可显著终止oxLDL造成EC的损伤，反映在EC细胞活力下降、LDH释放和EC细胞凋亡增加以及caspase-3酶活性增强等多个方面，miR-126可以抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，恢复细胞自噬功能，研究认为miR-126是逆转AS病变潜在的治疗靶点[19]。miR-126表达在血管EC，参与了AS的炎症过程，并可抑制炎症因子，促进EC细胞自噬，从而维护血管完整性起到抗AS的作用。外源性补充miR-126有望成为潜在的抑制AS炎症的治疗手段和策略，同时外周血检测miR-126也是可动态反映AS炎症和疾病严重程度的一个生物学指标。

5 let-7家族

let-7家族是炎症应答中起重要作用的一类miRNA，AS重要的病理机制是VSMCs增殖和EC功能失调。临床糖尿病相关AS病变和ApoE-/-基因敲除小鼠模型中，主动脉斑块的let-7表达是降低的。体外实验采用血小板生长因子和TNF-α诱导VSMC和EC活化过程中，let-7表达降低。而小鼠尾静脉注射外源性let-7能对抗脂氧素A4(Lipoxin A4)引起的炎症反应，包括抑制炎症应答、细胞增殖和迁移，同时单核细胞黏附能力和NF-κB活性降低[20]。AS典型病理改变之一是巨噬细胞转化为泡沫细胞，台湾国立大学Wang等[21]研究表明，let-7g可减少巨噬细胞的这种转化，并减少泡沫细胞的凋亡，研究证实let-7g同时抑制了NF-κB经典和非经典途径。NF-κB与let-7g表达之间存在负反馈机制。let-7g的高表达可抑制巨噬细胞中的NF-κB过度活化，可预防AS病变发生。因此，let-7家族通过抑制NF-κB信号通路、减少炎症发生以及维护血管完整性，具有AS治疗作用。总体上let-7家族具有负调节作用，抑制巨噬细胞NF-κB炎症信号通路是已明确的机制。let-7家族是高度保守的miRNA，包括let-7a～let-7g等成员，其编码基因分属第3、9和21号染色体上，但目前尚未明确AS病变过程中let-7家族成员的各自作用，以及其对NF-κB信号通路上、下游信号的调节，这些问题有待于进一步深入研究。

6 miR-145

AS形成中的一个重要环节是VSMCs过度增殖和迁移。人VSMCs高糖条件体外培养实验中，缺乏miR-145将导致VSMCs过度增殖和迁移，外源性补充miR-145则可有效抑制VSMCs的增殖和迁移。研究结果表明，miR-145通过下调ROCK1(一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)活性对高糖条件下VSMCs增殖和迁移有抑制作用，为糖尿病AS提供了一个治疗靶点[22]。在VSMCs培养中，miR-145和CD40分别作用于TNF-α、TGF-β和同型半胱氨酸并诱导细胞增殖，实验采用过表达miR-145或小干扰性RNA(small interference RNA,siRNA)介导敲低CD40的方法进行研究,对AS合并脑梗患者采用超声观察颈动脉内膜中层厚度方法评估VSMCs增殖状况。Guo等[23]研究发现，TNF-α、TGF-β和同型半胱氨酸均能显著增加CD40和其mRNA的表达，同时诱导VSMCs增殖；过度表达miR-145可显著抑制CD40表达以及VSMCs的分化，同时VSMCs培养上清液中IL-6降低。AS伴脑梗死患者miR-145低表达与颈动脉内膜中层厚度增厚以及血浆IL-6水平升高相关。因此，该研究认为miR-145/CD40通路涉及VSMCs增殖表型转换(包括TNF-α、TGF-β和同型半胱氨酸)，增强miR-145表达可能是一种有用的AS治疗策略。近期我国山东学者研究了AS发生发展过程中miR-145的作用。该研究采用ApoE-/-基因敲除并给予高脂饮食后小鼠模型体内、外实验，观察oxLDL诱导的巨噬细胞炎症反应。体内、外实验研究均显示，高表达miR-145 可通过促进NF-κB、p-IκBα、p-STAT3和ac-p65 表达增加IL-1β、TNF-α、CCL-2、CCL-4和CCL-7水平。低表达miR-145可缓解主动脉窦损害，增加VSMCs细胞数量并减少巨噬细胞炎症。该研究认为，miR-145通过活化NF-κB信号通路加剧了AS炎症反应[24]。虽然该文献与上述两个研究结论不一，但研究具有一个共同点，即miR-145均可抑制VSMCs增殖。VSMCs细胞的增殖在什么程度上有益于血管炎症修复，抑或可引起血管狭窄，以及AS患者miR-145表达的阈值仍有待于今后研究阐明。

7 miR-19

Chen等[25]用微阵列分析方法检测到AS患者血清中高表达miR-19a，miR-19a的靶基因是HMG盒转录因子1(HMG-Box transcription factor 1,HBP-1)，miR-19a通过抑制HBP-1增加巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibiting factor,MIF)表达，由此提高TNF-α和IL-6水平，从而促进巨噬细胞脂质吸收形成泡沫细胞。ApoE-/-基因敲除并给予高脂饮食小鼠尾静脉注射miR-19a拮抗剂，其AS斑块和脂质负荷有所下降，因此，抑制miR-19a的表达可减少AS炎症反应。参与AS病变损伤的各种类型细胞均可表达缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)，HIF-1α与炎症反应损害相关。少量oxLDL刺激EC即可增高miR-19a表达，这种现象是由CXCL1上调介导产生的，并导致单核细胞黏附能力增强。研究表明，抑制EC的HIF-1α/miR-19a 通路可能是治疗AS的方法[26]。miR-19b与ATP结合转录子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)的mRNA 3′UTR紧密结合，抑制了巨噬细胞胆固醇流出，促进形成泡沫细胞，导致主动脉斑块变大以及脂质含量增高，促进AS加剧[27]。总之，miR-19a/b的表达均促进了AS发生发展，可作为AS的临床进展和预后的实验室检测指标之一。

8 miR-221/222

miR-221/222参与调控VSMCs功能，促进血管重塑，以应对血管损伤。AS斑块破裂与斑块纤维帽肩部区miR-221/222的表达减少和p27Kip1 (是一种细胞周期依赖的酶抑制剂)mRNA增加有关，而p27Kip1增加则VSMCs增殖减少。因此，降低miR-221/222的表达可增加AS斑块破裂发生的可能性[28]。Jia等[29]报道miR-221与AS疾病呈负相关，外周血低表达miR-221是AS危险因素之一。近期研究表明AS小鼠斑块中高表达长链非编码RNA(lncRNA)GAS5，GAS5作为内源性分子海绵直接与miR-221结合抑制其表达，可诱导促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α及MMP的水平增高，导致AS斑块表面纤维帽降解并且加剧斑块不稳定性[30]。土耳其近期临床研究提示，伴有冠状动脉粥样斑块(Coronary artery atherosclerotic plaques,CAAP)患者血浆中miR-221表达比健康对照组高8.94倍，血浆中miR-221表达水平增高的为单纯高胆固醇血症、高血压和有冠心病家族史的患者，与正常对照组比较差异均存在显著统计学意义；但各组患者血浆中miR-222的表达并无统计学意义[31]。土耳其的研究与上述各研究结果不同，小鼠AS模型斑块局部miR-221/222的表达和患者外周血表达不一，而目前比较公认的是miR-221/222在机体脂质形成和累积过程中表达是降低的，对于miR-221/222在血管炎症反应各阶段和疾病部位的诊断意义尚待进一步研究。

9 miR-10a

最新临床研究显示，在冠心病患者外周血单个核细胞中miR-10a表达下调，miR-10a与血清IL-6和TNF-α水平呈负相关，与IL-10水平呈正相关，但该研究提出miR-10a与AS的潜在炎症相关机制有待进一步研究[32]。我国台湾台北科技大学Lee等[33]研究认为，miR-10a 是特异性调节AS易感区域EC的血管振荡剪切力(Oscillatory shear stress,OS)的miRNA。给予ApoE-/-基因敲除小鼠维甲酸受体-α(Retinoic acid receptor-α,RARα)/视黄醇类X受体-α(Retinoid X receptor-α,RXRα)的特异性激动剂，可增加EC内的miR-10a表达，从而减少AS主动脉EC损害。研究提出miR-10a是通过RARα组蛋白去乙酰化复合物抑制了下游GATA6/VCAM-1(Vascular cell adhesion molecule 1)信号通路，从而阻止了炎症级联效应。该研究认为，RARα/RXRα特异性激动剂可提高EC的miR-10a表达，有望成为血流动力学意义上治疗AS的潜在药物。Wei等[34]研究发现，在AS发病过程中，泡沫细胞可加剧巨噬细胞内Dicer酶缺乏，损害了线粒体脂肪酸氧化代谢,miR-10a通过抑制配体依赖性核受体共抑制因子(Ligand-dependent nuclear receptor co-repressor,Lcor)修复Dicer活性，促进线粒体脂肪酸氧化，缓解AS进展。促进巨噬细胞的Dicer酶/miR-10a通路和代谢重编程可能是AS治疗的潜在靶点。

10 miR-195

巨噬细胞是AS斑块的主要组成部分，其中M1型巨噬细胞促进AS的发生，而M2型巨噬细胞具有稳定斑块的作用。此外，TLR信号通路参与了AS斑块形成、进展和消退。有研究采用LPS和IFN-γ刺激巨噬细胞THP-1细胞株，过表达miR-195可使TLR-2水平下降，巨噬细胞中JNK p54、JNK p46 和 MAPK p38磷酸化下降，并且细胞培养上清液中IL-1β、IL-6 和 TNF-α前炎症因子显著下降。miR-195削弱了M1巨噬细胞所致的平滑肌细胞募集和迁移分布的功能。该研究认为，miR-195参与了巨噬细胞极化，并通过抑制TLR2炎症通路炎性介质，缓解心血管疾病炎症过程[35]。我国厦门大学最新研究显示，miR-195和miR-582可调节EC释放一氧化氮(Nitric oxide,NO)，它们与eNOS3 mRNA 3′UTR直接结合，导致EC NO减少的释放，同时避免触发血小板的活化、黏附和凝聚，增加血管EC对NO生物利用度，阻止血栓形成[36]。另有研究表明，皮质类固醇可诱导间质干细胞分化，被诱导出的巨噬细胞、脂肪细胞和成骨细胞高表达miR-195[37]。miR-195在AS病理作用机制方面研究尚少，有待进一步深入研究。

总之，AS是以脂质和炎症细胞在动脉壁堆积浸润为特征的慢性炎症性疾病。miRNA对AS病理生理过程尤其是慢性炎症具有调控作用。miRNA在体内主要起RNA干扰(RNA interference，RNAi)作用。对miRNA的研究一方面是为了阐明AS炎症信号通路RNAi的作用机制，如大部分miRNA通过抑制或促进TLR、NF-κB、JNK、MAPK以及eNOS等信号通路调节炎症的发生和发展，同时影响泡沫细胞形成以及斑块稳定性等；miRNA也参与黏附分子介导、EC增殖、分化及迁移等过程调控血管炎症，此外miRNA对胆固醇流出和细胞自噬等也有重要作用；另一方面，随着近期国际上第一个RNAi药物的诞生[38]，更多的此类药物将很快进入各种疾病的治疗领域[39]，包括心血管疾病的治疗；其三，中药是我国以及亚洲等区域使用数千年的药物，也已广泛应用于AS的临床治疗中。中药除动物药和矿物药外，绝大部分是植物药，已被研究的含有miRNA的中药种类均为我国常用的植物药，包括人参、黄芪、甘草和地黄等，其安全性方面与化学分子设计合成的miRNA类药物比较有着先天的优势，一般而言，中药是已经过人类长期食用后筛选出来的安全食物和药物。如我院沈朝斌等[40]研究团队采用二代深度高通量测序方法测定了黄芪水煎剂的miRNA表达谱，实验结果鉴定了黄芪中1个保守的miRNA和9个新发现的miRNA。经进一步生物学信息分析，发现12种Ⅰ类siRNA序列，它的5′端对热力学不稳定，在3′端种子区域对热力学高度稳定。该研究证明了植物药存在热力学意义上稳定的siRNA，同时也建立了单味黄芪饮片完整的miRNA谱系。这些中药的miRNA均有望在AS发病机理研究和新药开发方面崭露头角。