张秀华，路伟，苏玮玮，李淑芬

（华威特（江苏）生物制药有限公司，泰州 225300）

牛呼吸道合胞体病是由牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus, BRSV）引起的一种急性、热性传染病。该病以发热、流泪、流鼻液、流涎、呼吸急迫、咳嗽、乳牛泌乳量显著下降和严重的间质性肺炎等为主要特征。1967年，Paccaud和Jacquier在瑞士首次从牛体内分离到BRSV。日本、比利时、英国、加拿大和美国等国也相继分离出该病毒。北美BRSV特异性抗体阳性牛达81%，美国南部地区BRSV的血清阳性率要高于北部地区。在美国，呼吸疾病患牛的死亡率达到13%。在加拿大，BRSV的总感染率将近36%。墨西哥的两个不同地区感染率分别达52%和90.8%。瑞典牛奶中BRSV抗体的检出率高达41%～89%。丹麦、比利时、英国等国家也都有BRSV感染的报道，且发病率也较高。埃塞俄比亚和南非的BRSV感染发病率也较高。其他国家，如土耳其也有较高的血清阳性率（达43%）[1]。2007年，王红等从国内发生牛呼吸道病的某牛场分离出BRSV[2]，说明BRSV感染在国内也是存在的，但尚无较大规模的血清流行病学研究报告。BRSV可以感染各年龄段的牛、绵羊、山羊及其他易感动物，大多数为无症状感染[3]，而且BRSV可通过再次感染或携带者在畜群中持续存在，导致治疗费用不断增加。

1 诊断方法

1.1 病毒分离与鉴定

动物病死后的病料不易分离到病毒，发病牛的气管或者肺脏的冲洗液、病牛鼻腔深部的鼻液可作为病毒分离的病料。常用细胞有猴肾（Vero）细胞、牛肾（MDBK）细胞和牛鼻甲细胞系（BT），其中BT细胞对该病毒最敏感，适于作为分离和培养病毒之用。BRSV在牛鼻甲细胞上可形成其独特、可见的合胞体及胞浆包涵体[3]。BRSV对热及恶劣环境敏感，表现不稳定，在运输过程中极易失活。同其他病毒分离一样，BRSV的分离被认为是诊断的“黄金标准”，但是病毒分离一般需要数个星期，而且阳性率低、成本高，进一步鉴定还需要免疫荧光或者分子生物学方法检测，因此，不适用于临床早期诊断和疫情应急诊断。

1.2 血清学检测

血清学检测对牛呼吸道合胞体病的诊断和流行病学调查均具有重要意义。目前，应用最多的有血清中和试验（SNT）、间接免疫荧光试验（IFA）、补体结合试验（CFT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。

1.2.1 血清中和试验（SNT）

SNT是经典的血清学检测方法。该试验的周期需要1周左右，而且操作繁琐，所以很少用于临床疾病的快速诊断，且无法诊断人工免疫后的动物[4]。应用抗BRSV阳性血清进行SNT，往往可以确定待检的样本是否为BRSV，并且新检测方法的建立都将SNT作为依据标准，并与SNT进行比较以确定新检测方法的敏感性。

1.2.2 补体结合试验（CFT）

CFT是用免疫溶血机制作为指示系统来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。Bostandzhieva等采用CFT对240份血清进行检测，检测出40份血清为阳性，感染率为18%，证明了该方法对疾病的检测有效。但此方法在国内外诊断实验室应用得很少。

1.2.3 免疫荧光检测（IFA）

IFA是目前应用较广泛的BRSV快速检测技术，其原理是用荧光素标记的抗体和相应抗原形成免疫复合物，借助荧光显微镜观察细胞内病毒抗原及其存在的位置。将IFA用于自然感染牛和试验感染牛鼻咽上皮细胞中BRSV抗原的检测，但未能获得满意结果。Quinting等建立了一种间接免疫荧光法检测发病牛器官匀浆液中的BRSV抗原，整个检测只需1.5h，与Real-time RT-PCR法相比，该方法更敏感和特异。IFA检测的病料（如肺脏及气管组织等）必须是新鲜或速冻的病料，因为在福尔马林等化学品固定的病料中，BRSV抗原往往受到较大的破坏，诊断结果的准确性有所降低[5]。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是一项已在动物疫病诊断工作中得到广泛应用的血清学诊断技术。由于酶的高效催化作用使其对抗原抗体结合识别起到了放大作用，从而达到了快速、灵敏、高效的检测要求，是一种重要的疫病早期诊断方法[4]。ELISA适合检验大批标本和微量标本，被列为诊断BRSV感染的常规检测方法。目前国际上用于检测BRSV抗体的间接ELISA诊断方法主要针对的是BRSV的N蛋白、F蛋白和G蛋白。N蛋白具有良好的稳定性和特异性，常被用于包被抗原，进而建立诊断BRSV抗体的有效方法。目前利用纯化的BRSV为抗原建立了检测牛奶和血清中BRSV抗体的间接ELISA方法，结果表明该方法快速可靠。有学者使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞内表达BRSV N蛋白，并以此重组N蛋白为抗原建立了间接ELISA诊断方法，对感染牛血清进行了流行病学调查。此外，也有使用杆状病毒表达载体表达的F蛋白作为包被抗原，建立检测BRSV血清抗体的间接ELISA方法的。与SNT相比较，该方法快速、敏感、特异。利用G蛋白建立的间接G-ELISA诊断方法不仅比传统的间接F-ELISA诊断方法更敏感，而且还可以区分亚型。冯军科等应用纯化的重组蛋白G1为包被抗原，检测国内牛血清中的BRSV抗体，建立了牛呼吸道合胞体病毒G蛋白的血清学诊断方法[6]。

1.3 分子生物学方法

1.3.1 聚合酶链式反应（PCR）

以特异性强、敏感性高、高效快速为特点的PCR已经成为实验室诊断最常用的方法。该方法已广泛用于BRSV的检测。与病毒分离和IFA相比，PCR的结果不受标本病毒失活的影响，也不需要完整的受感染细胞，但是PCR反应的条件选择非常严格，扩增所用引物具有较强的特异性。Larsen等应用RT-PCR方法对自然和试验感染牛肺组织中BRSV的F基因进行检测，结果表明该方法较敏感、可靠。Valarcher等应用nRT-PCR方法对BRSV的N基因进行检测，结果表明该方法敏感性高、特异性强，适合BRSV的诊断和分子流行病学调查。Boxus等利用实时定量RT-PCR方法从被感染牛的气管和肺脏的灌洗液中检测到BRSV，灵敏度是传统RTPCR的100倍，并且能够对感染14d后的肺脏灌洗液进行病毒定量。史鸿飞等首次用套式RT-PCR技术证实了我国部分省份牛群中存在BRSV感染[7]。

1.3.2 原位杂交技术(ISH)

ISH是将组织化学与经典的核酸杂交技术相结合衍生出来的可定位检测核酸分子的病理学技术，可在组织、细胞或染色体上原位检测是否存在目的DNA或RNA片段。西班牙学者Masot等应用原位杂交（ISH）技术检测了试验感染牛呼吸道合胞体病毒（BRSV），并检测了不同时间内在羔羊肺中的分布情况[8]。

1.3.3 环介导等温扩增技术(LAMP)

LAMP是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在等温条件下进行扩增反应的技术。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在15～60min扩增109～1 010倍；所有靶基因序列的检测可通过扩增产物的有、无来判断。有无扩增反应是利用添加荧光染料的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应的沉淀浊度来判定的。可根据BRSV的保守基因设计4条特异性引物，建立BRSV环介导等温扩增方法，为牛呼吸道疾病的准确诊断提供新的方法。环介导等温扩增方法具有特异性强、灵敏度高、扩增高效、快速、设备简单、鉴定简便等优点，适于在基层推广和应用。

2 防治

2.1 免疫预防

经过几十年的努力，BRSV疫苗的研究已取得了显著的进展，BRSV疫苗一般在免疫系统不健全和母源抗体存在时能诱导有效的免疫反应，产生具有中和活性的血清抗体和黏膜抗体。目前上市的主要有两种疫苗：①灭活苗。可诱导犊牛产生高水平的中和抗体，但并不能保护所有免疫牛免于感染。②弱毒苗。Kubota等报道，BRSV在低温(30℃)条件下通过HAL继代获得rs-52株，用它接种犊牛，既不出现临床症状和排毒现象，又能抵抗强毒的攻击，且抗体持续期长，可有效预防BRSV感染。Xue等报道，采用多联活疫苗（包含5个病毒抗原BVDV1、BVDV2、IBRV、PI3V和BRSV）免疫3～8日龄的小牛，免疫后与未免动物攻毒后比较，该多联活疫苗免疫动物的临床症状、肺部变化、白细胞和血小板减少数量大大降低，虽然大多数免疫动物依然排毒，但是与未接种动物相比，排毒期和排毒量大幅度降低，证明该5联活疫苗安全有效[9]。而Taylor报道，人呼吸道合胞体病毒对温度敏感的突变株ts-1虽然对牛的毒力明显减弱，但不能完全保护犊牛免于BRSV感染[10]。

近年的研究表明，有效的副黏病毒疫苗能诱导针对病毒表面糖蛋白的抗F、G抗体的产生，尤其是抗F抗体，这为研制BRSV的生物技术疫苗提供了重要依据。目前已研制了用牛疱疹病毒作载体表达BRSV的G蛋白重组疫苗，可诱导黏膜免疫使牛得到保护。采用重组牛痘病毒表达的F蛋白免疫小牛能够产生IgG抗体和诱导CD8+T细胞反应，不能产生IgE抗体，同时该疫苗能够抵抗BRSV的攻击[11]。

BRSV感染或者疫苗接种所产生的免疫力时间很短，可能仅能持续3～4个月，其原因目前尚不清楚，但是可以解释BRSV发生频繁甚至反复感染免疫动物和非免疫动物的原因。因此，频繁的免疫能够控制该病的发生。怀孕母畜接种BRSV病毒活疫苗是安全的，且能够将母源抗体转移给小牛。有证据表明，具有母源抗体的小牛接种疫苗易产生免疫应答。用含有BRSV抗原的三联灭活疫苗免疫哺乳小牛，抗原能够冲破母源抗体干扰产生免疫保护，推测二免后抗体水平将更高[12]。

值得注意的是，大多数情况下BRSV并不是独立存在的，它往往与其他的牛传染性呼吸道致病原同时感染牛，造成典型的“运输热”或“干草热”。这些致病原包括牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、传染性牛鼻气管炎病毒（IBR）、牛副流感病毒3型（PI-3）、牛呼吸道冠状病毒（rBCoV）、溶血性巴氏杆菌以及牛支原体等。试验证明，与其他病原共同感染的BRSV对牛造成的临床疾病更严重。因此，有效地防控其他病原，也是有效防控BRSV感染的必要条件。

2.2 治疗

牛呼吸道合胞体病目前没有特效疗法，只能采取对症治疗。发生BRSV感染的牛经常表现脱水，需要补充水分和电解质；另外，被感染牛易继发感染溶血性巴氏杆菌、坏死性巴氏杆菌以及牛支原体等，可直接采用广谱的抗生素防止细菌继发感染，采用皮质类固醇药物控制过敏反应等。短期使用皮质类固醇药物可以缓和呼吸困难的症状，但是该药物有免疫抑制作用，能够加重牛呼吸道合胞体病的病情和继发感染，因此在使用皮质类固醇药物时要慎重，如果不是急性症状，勿轻易使用。

2.3 综合措施

每日及时清理牛舍地面及运动场的粪便，同时对地面、用具、工作服等严格消毒。经常观察牛群，发现病牛应立即隔离或淘汰。对外界引进的牛只，一律采取隔离、检疫措施，确诊无病才能入群。对于受威胁的牛，应全面接种疫苗，以预防本病发生。另外，减少小牛特别是易感小牛与成年牛的接触是简单有效的控制手段。