刘 乾, 管思彬, 韩锋锋, 郭雪君

(上海交通大学医学院附属新华医院, 上海 200062)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种以气流受限为特征的常见呼吸系统疾病，其患病率及死亡率近年来上升迅速，到2020年，COPD将成为全球第三大致死疾病[1]。气道重塑是COPD发生发展中气流受限的重要病理生理学基础，主要发生在直径小于2 mm的小气道，突出表现为气道上皮组织的异常修复和肌成纤维细胞的募集[2,3], 促使细胞外基质沉积增加。目前临床治疗COPD的方案不能从根本上控制气道重塑的进展，无法提高远期生存率以及降低患者住院率和死亡率。因此, 针对COPD气道重塑, 尤其是小气道纤维化的发生机制及预防与治疗已成为当今医学领域研究的重点与热点。

人参皂甙Rg1属三萜类原人参三醇型皂甙，是人参总皂甙的主要成分。具有抗炎、抗氧化应激、提高认知能力等多种药理效用。近年来, 多项研究[4,5]表明人参皂甙Rg1可以影响多种细胞的间质转化过程，如肾小管上皮细胞、肝癌细胞、心肌细胞等。人参皂甙Rg1能否通过抑制上皮间充质转化(EMT)降低肌成纤维细胞的募集与活化，进而减轻COPD小气道纤维化、改善气道重塑，目前尚无类似研究。为了解人参皂甙Rg1对COPD大鼠肺功能及肺上皮间充质转化(EMT)的影响。本实验初步探讨了人参皂甙Rg1对COPD小气道纤维化的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 制备COPD大鼠模型与分组

8周龄SPF级雄性SD大鼠, 体质量160～200 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2012-0002]，饲养于上海交通大学医学院附属新华医院实验动物中心[SYXK(沪)2013-0031]。动物分组: 随机数字法将大鼠分为正常对照组(Normal)、COPD组(烟熏造模大鼠组)、COPD + 低剂量Rg1组(烟熏造模大鼠人参皂甙Rg1灌胃每日5 mg/kg，Rg1-5 mg)、COPD + 中剂量Rg1组(烟熏造模大鼠人参皂甙Rg1灌胃每日10 mg/kg, Rg1-10 mg)、COPD + 高剂量Rg1组(烟熏造模大鼠人参皂甙Rg1灌胃每日20 mg/kg， Rg1-20 mg)。每组10只大鼠。使用烤烟型大前门香烟(购自上海烟草集团公司，焦油含量为11 mg)，模型组每日上午在自制有机玻璃箱(容积为60 L，长宽高分别为50 cm，40 cm, 30 cm)内被动吸烟。除正常组外，每5只大鼠1箱, 每日每箱大鼠烟熏“大前门香烟”24支,分为上午和下午(上午和下午烟熏间隔5 h)，每次烟熏12支，每次烟熏时间维持40 min左右。每周烟熏6 d，持续烟熏12周。人参皂甙Rg1预处理COPD大鼠模型：在上午烟熏前30 min对人参皂甙Rg1低、中、高剂量组给予Rg1灌胃预处理，每周日测量体质量，根据体质量调整下周各组灌胃药量。实验结束后，2%戊巴比妥钠按50 mg/kg的剂量腹腔注射处理动物。

1.2 大鼠肺功能检测

连接肺功能仪各导联，平衡肺功能仪。将大鼠仰卧位置于密闭体积扫描箱内，通过气管插管连接大鼠与肺功能仪，机械通气，以AniRes2005动物肺功能分析系统进行数据采集和转换，肺功能测定指标包括：肺动态顺应性(dynamic compliance，Cdyn)、潮气量(tidal volume，VT)和气道阻力(lung resistance，RL)。

1.3 病理组织学分析

将肺组织于质量分数4%多聚甲醛内固定24 h,石蜡包埋，行HE染色，Masson染色后于光学显微镜下观察。免疫组织化学法检测大鼠肺组织E钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达。

1.4 实时定量聚合酶链式反应(RT- PCR)

提取总RNA经逆转录后进行RT-PCR。循环条件如下: 预变性 95 ℃ 30 s; PCR反应, 95 ℃ 5 s, 60 ℃34 s, 进行40个循环。使用相对定量2-△△Ct的方法进行分析, 将记录的CT值用2-△△Ct计算实验组目的基因的表达量相对于正常对照组的变化倍数,△△Ct=(CT目的基因-CT管家基因)实验组-(CT目的基因-CT管家基因)正常对照组, 实验重复3次。

1.5 统计方法

数据以±s表示，采用Graphpad Prism 5.0 Software(San Diego，CA)进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂甙Rg1对大鼠肺功能的影响

与正常对照组相比, COPD组大鼠RL增加33.2%,Cdyn降低31% (P＜0.01)。中、高剂量人参皂甙Rg1干预可以减轻上述改变, RL分别增加23.4%和15.1%,Cdyn分别降低10.8%和8.1%, 与COPD组相比有显著性差异(P＜0.01)。低剂量人参皂甙Rg1组的RL与COPD组相比无明显差异(P＞0.05), 但Cdyn较COPD组增高(P＜0.01)。各组VT无显著性差异(图1)。

图 1 各组大鼠肺功能检测Figure 1 Pulmonary function of rats

2.2 人参皂甙Rg1对COPD大鼠肺气肿的影响

肺组织病理切片HE染色后显微镜下观察，正常对照组大鼠支气管黏膜上皮结构完整，纤毛排列整齐，未见腺体增生，气管壁光滑，肺血管平滑肌未见增厚，支气管及血管周围无炎症细胞浸润，肺泡间隔未见明显断裂与融合(图2A)。COPD组见明显的肺组织结构破坏，支气管黏膜上皮脱落，纤毛明显变短、倒伏，支气管平滑肌增厚，支气管周围见大量炎症细胞浸润，有腺体增生，肺泡明显扩张，部分肺泡间隔断裂、融合，部分中小血管见血管壁增厚(图2B)。COPD+Rg1低、中、高剂量组可见支气管周围炎症细胞浸润较COPD组有改善，肺组织结构破坏、肺泡扩张减轻，支气管粘液分泌减少(图2C、D、E)。

图 2 肺组织HE染色(×100)Figure 2 HE staining of lung tissue (×100 magnificantion)

用平均肺泡数(mean alveoli number，MAN)和平均肺泡内衬间隔(mean linear intercept, MLI)评估肺气肿程度。每张切片在光学显微镜下10×10倍采集4个视野，避开大血管和支气管进行评估。结果(表1)显示，COPD组MAN值最低，与Normal组比较有统计学差异; 中、高剂量Rg1处理组的MAN较CODP组显著增高(P＜0.05)。COPD组MLI值最高， 与Normal组差异有统计学意义; 中、高剂量Rg1干预组的MLI较COPD组降低(P＜0.05)。

2.3 人参皂甙Rg1对COPD大鼠肺EMT的影响

与Normal组相比, COPD组E-cad表达明显降低, 人参皂甙Rg1干预组E-cad表达较COPD组增高;COPD组α-SMA表达明显升高，人参皂甙干预组α-SMA表达较COPD组降低。与Normal组相比，人参皂甙Rg1低、中、高剂量干预后, E-cad表达升高，而α-SMA表达明显减低。用Image Pro Plus 6.0 软件对免疫组织化学图片中代表E-cad的深褐色颗粒和代表α-SMA的淡棕色颗粒进行统计分析，结果显示各组间的E-cad和α-SMA表达差异有统计学意义(n=6,P＜0.05)。人参皂甙Rg1可以增加肺组织E-cad的表达, 减低α-SMA的表达(图3)。

表 1 大鼠肺组织平均肺泡数(MAN)和肺泡内衬间隔(MLI)Table 1 Mean alveoli number (MAN) and mean linear intercept (MLI) of lung tissue in rats

以RT-PCR法检测肺组织E-cad和α-SMA的mRNA表达水平, 以GAPDH为内参, 结果显示，与Normal组相比, COPD组肺组织中E-cadmRNA的相对表达量明显下降, 为Normal组的0.37 ± 0.11倍,α-SMAmRNA的相对表达量明显增高，增高为3.29 ±0.57倍。COPD+Rg1中、高剂量组的E-cadmRNA 表达较COPD组升高，分别是Normal组的0.66 ± 0.06 倍和0.78 ± 0.07 倍，COPD +Rg1 低剂量组的E-cadmRNA表达与COPD组相比无显著性差异。而COPD+Rg1低、中、高剂量组α-SMAmRNA 表达水平较COPD组降低, 分别是Normal组的2.45 ± 0.16倍、1.56 ± 0.30倍和1.31± 0.10倍(P＜0.05)(图 4)。

图 3 免疫组织化学检测肺组织E-cad和α-SMA蛋白表达Figure 3 E-cad and α-SMA protein expression in lung tissue by in immunohistochemistry

图 4 RT-PCR检测肺组织E-cad和α-SMA的 mRNA表达Figure 4 E-cad and α-SMA mRNA expression in lung tissue by real-time PCR

3 讨论

COPD是一种以气流受限为特征的常见呼吸系统疾病，气流受限持续存在并进行性发展，与气道和肺对有害颗粒和气体的异常炎症反应增加有关。气道重塑是COPD重要的病理生理基础，慢性气道炎症损伤气道上皮，异常修复与损伤反复进行，诱导EMT发生，表型改变的上皮细胞分泌大量细胞外基质，同时成纤维细胞在炎症刺激下向肌成纤维细胞转化，合成胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质能力增强，最终导致小气道纤维化、气道狭窄、阻力增加。

人参为传统中药，人参皂甙Rg1活性高，作用广泛，对中枢神经系统、心血管系统、泌尿系统、免疫系统均有积极作用[6-9]。现有研究[10,11]已证实人参及其提取物能提高COPD患者1s用力呼气量(FEV1)、FEV1/用力肺活量(FVC)，圣乔治呼吸问卷(SGRQ)结果提示生活质量有明显改善。

本实验使用烟熏法建立COPD大鼠模型[12]，通过肺组织病理和肺功能变化评估COPD造模是否成功。以灌胃法进行人参皂甙Rg1干预。肺组织病理HE染色结果提示，中、高剂量人参皂甙Rg1可以改善COPD大鼠肺组织破坏，减少MAN和MLI，减轻肺气肿程度。肺功能检测检测结果显示,COPD大鼠RL较正常对照组明显升高, Cdyn显著降低, 符合COPD肺功能改变, 而人参皂甙Rg1处理可以降低RL, 提高Cdyn, 改善肺功能。

EMT是极化的上皮细胞在生理和/或病理条件下经历多种生物化学改变最终获得间质细胞特性的过程，表现为上皮细胞标志物(E-cad、ZO-1)丢失，细胞紧密连接和粘附性下降或消失，细胞极性丢失，与正常上皮极性相关的细胞骨架结构也发生变化，侵袭和转移能力增强，获得间质标记物(α-SMA、vimentin、N-cadherin、S100A4 等), 最终演变为间质细胞(主要是成纤维细胞和肌成纤维细胞)。EMT是创伤愈合和组织修复的重要过程，但如果损伤和炎症持续进行, 就会加重组织纤维化程度, 导致肝脏、肾脏和小肠等多种器官纤维化[13-15]。近年来多项研究[16,17]表明，多种损伤和应激可以诱导气道EMT，促进COPD、哮喘和特发性肺纤维化等慢性气道疾病的发生发展。

E-cad主要分布于支气管上皮, α-SMA主要分布于气道周围及肺血管。免疫组织化学检测结果提示, 人参皂甙Rg1可以降低COPD大鼠肺内α-SMA蛋白表达, 升高E-cad蛋白表达, 这与Mahmood等[18]的研究结果相仿。RT- PCR检测E-cad和α-SMA在mRNA水平的表达, 结果也显示人参皂甙Rg1降低肺内α-SMA, 升高E-cad的mRNA表达。本实验显示, COPD大鼠肺组织E-cad表达明显降低, α-SMA表达显著升高，提示香烟烟雾可以诱导肺内EMT的发生，而人参皂甙Rg1可以抑制上述变化。

实验结果提示，人参皂甙Rg1可以减轻COPD大鼠肺气肿程度，改善肺功能，减轻COPD肺EMT过程。人参皂甙Rg1抑制EMT的发生发展对有效治疗COPD可能有积极意义。