葛煦，张彩勤，赵勇，白冰，谭邓旭，张贺，师长宏

(第四军医大学实验动物中心，西安 710032)

近红外(near-infrared, NIR)荧光染料具有高消光系数和较大的斯托克斯位移[1]，而正常组织在NIR光谱中几乎没有自发荧光，这样可以使用NIR染料使信号与背景的比值最大化，从而通过影像学模式有效检测肿瘤发生的部位[2]，具有特异性强、时间分辨率高、干扰小等优点，已成功应用于临床肿瘤的术中导航，尤其术中肿瘤切缘、残留灶和转移灶的识别。吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)是唯一被美国 FDA 批准用于临床的 NIRF 染料[3]，但其缺乏肿瘤特异性，稳定性差，在正常肝中也会显示高的吸收，易造成假阳性信号[4]。目前，NIR荧光成像在肿瘤的实验研究和临床应用方面显示出巨大的潜力，许多NIR化合物，如Cy5.5和IR800-CW，在用特异性抗原或实验肽标记后已成功用于肿瘤模型的诊断[5]。

七甲川菁(heptamethine carbocyanine, HC)近红外荧光染料能够被肿瘤细胞吸收并特异性聚集于肿瘤部位，不需标记任何靶标便可直接用于前列腺癌(prostate cancer, PCA)移植模型的活体成像，具有成像和靶分子的双重功能[6-7]。我们前期合成并筛选了一系列七甲川菁NIR染料，包括MHI-148和IR-783[8]。研究发现肿瘤细胞对该类染料的吸收主要通过缺氧和活化的HIF1α/OATPs信号实现，从而使该类染料具有了肿瘤靶向性[6]。依据该特征本研究计划将IR-783与化疗药物吉西他滨缀合形成偶联化合物(near-infrared-gemcitabine，NIRG)[7]，连续注射临床肝癌标本异种移植(patient-derived xenograft，PDX)小鼠模型，利用其识别肿瘤的特性转运化疗药物，通过活体成像实时监测化合物治疗效果，实现肿瘤的靶向治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

20只6～7周龄的雄性BALB/c 裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司 【SCXK(京)2014-0001】，饲养在第四军医大学屏障设施内【SYXK(陕)2014-001】。所有动物实验均获得第四军医大学实验动物福利伦理委员会的批准(No. 17018)。

1.1.2 细胞系和试剂

人肝癌细胞系Hep3B2.1-7(Hep3B)购自美国ATCC细胞库，通过慢病毒转染Luc-Puro构建稳定表达Luc的细胞系(Hep3B-Luc)，由本实验室保存[7]。细胞培养在10%胎牛血清的MEM培养液中，含1% 青霉素/链霉素(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)。肝癌手术标本来自西京医院肝胆脾胰外科(实验室编号分别为C64003，C34566和B66873)，相关临床实验均获得西京医院伦理委员会的批准(批准编号：2015432)。MitoTracker(货号ab112144)和LysoTracker(货号ab112136)以及CEA(货号ab4451)、AFP(货号ab46799)和OATP(货号ab15441)抗体购自Abcam公司，HIF1α(货号610958)抗体购自BD公司。七甲川菁近红外荧光染料IR-783与化疗药物吉西他滨缀合形成的偶联化合物NIRG(化学结构式见参考文献7)由美国Cedars-Sinai Medical Center(Los Angeles，CA)的 Leland Chung教授提供[7]。

1.2 方法

1.2.1 肝癌细胞对NIRG的特异性吸收

为了测定NIRG在肿瘤细胞内的结合部位，人肝癌细胞系Hep3B在24孔板培养24 h后分别加入MitoTracker(200 nmol/L)或 LysoTracker(75 nmol/L)37℃ 作用30 min后，PBS洗涤，加入NIRG溶液(20 μmol/L)继续作用30 min，PBS洗涤后，在荧光显微镜下观察NIRG在线粒体和溶酶体中的结合(Olympus IX71, Olympus, Melville, NY, Jap，配备ICG滤光片，发射/激发：750-800/820-860 nm)。

1.2.2 肝癌裸鼠皮下移植瘤的NIRF 成像

实验中裸鼠麻醉采用腹腔注射氯胺酮(100 mg/mL)和甲苯噻嗪(20 mg/mL)混合溶液，手术和成像实验中采用异氟烷吸入麻醉。

将不同浓度的Hep3B-Luc细胞(1×106，3×106，和9×106)分别接种裸鼠右后肢皮下。两周后，上述裸鼠腹腔注射NIRG 1 μmol/(L·kg)溶液100 μL，24 h后采用配备有ICG滤光片的(发射/激发：750-800/820-860 nm)小动物活体成像系统(Lumina II Small Animal Optical Imaging System)检测肿瘤部位NIRF 强度。同时按照1.5 mg/mouse剂量腹腔注射荧光素酶底物(Gold Biotechnology，Olivette, MO, USA)，同样检测肿瘤部位生物发光强度(bioluminescence intensity，BLI)，分析NIRF 强度与BLI信号的相关性。

1.2.3 IR-783介导的化疗药物对肝癌PDX模型的治疗

来自临床的肝癌手术标本被切成3 mm3大小，无菌浸泡处理后，套管针移植入裸鼠背部皮下(每组5只)。1月后，肿瘤开始生长，计数为F0代，取其组织块用4%多聚甲醛固定后，切片，进行HE染色。肿瘤一抗AFP 37℃孵育2 h，加入二抗(羊抗鼠)室温孵育20 min，DAB显色后，苏木精复染脱水透明封片晾干，光学显微镜下观察。同时免疫组织化学测定HIF1α和OATP的表达。PDX模型肿瘤组织连续传代。取其F3代瘤组织移植裸鼠皮下，待肿瘤长至100 mm3后，分成两组(每组5只)分别腹腔注射 NIRG(10 mg/kg)和生理盐水，每周2次，连续治疗4周，测定肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。

2 结果

2.1 肝癌皮下移植瘤对NIRG的特异性吸收

利用人肝癌细胞系Hep3B-Luc成功建立裸鼠皮下移植模型，分别注射NIRG染料和荧光素底物后，活体成像同时测定肿瘤部位NIRF信号和生物发光(BIL)信号。结果发现NIRG特异性富集于肿瘤部位，随着肿瘤的生长，NIRF信号和BIL信号均增强(图1A)，且二者具有良好的相关性(R2=0.99716，图1B)。

注：裸鼠皮下注射肝癌Hep3B-Luc细胞后建立的移植模型分别注射酶底物和NIRG后进行NIRF/BLI成像(1A)。计算 NIRF强度与BLI信号强度的相关性(n=5)(1B)。图1 定量分析NIRG在肝癌模型中介导的荧光信号Note. Hep3B-Luc cells were subcutaneously injected into nude mice. The implanted models were injected with the enzyme substrate and NIRG, and subjected to NIRF/BLI imaging (1A). The correlation between NIRF intensity and BLI signal was calculated (n=5) (1B).Figure 1 Quantitative analysis of fluorescent signals mediated by NIRG in liver cancer models

2.2 肝癌细胞与 NIRG染料的特异性性结合

荧光显微镜下发现NIRG信号聚集于肝癌细胞Hep3B(图2)。为了进一步明确NIRF染料在细胞器内的结合部位, 我们将Hep3B 细胞和NIRG分别与MitoTracker、LysoTracker特异性探针共孵育。结果如图2，NIRG近红外荧光信号共定位于Hep3B细胞黄色的MitoTracker探针或绿色的LysoTracker 探针部位，提示NIRF染料在肿瘤细胞内结合的部位分别为线粒体和溶酶体。

2.3 肝癌PDX模型的建立及NIRF活体成像

三例肝癌手术标本移植裸鼠皮下后，平均大约3个月后才形成肉眼可见的肿瘤，待肿瘤长至500 mm3后，连续体内传代3次后，肿瘤生长的潜伏期稳定至20 d。取原发瘤和转移瘤HE染色发现，二者在组织形态方面保持了较好的一致性(图3)。免疫组织化学检测显示肝癌特异性抗原AFP高表达，与NIRF染料特异性吸收相关的抗原HIF1α和OATP均高表达(图4)。

注：NIRF为化合物NIRG在肿瘤细胞内激发的荧光，绿色为溶酶体特异性探针，橙色为线粒体特异性探针，DAPI为细胞核特性探针。图2 NIRG特异性聚集于肝癌细胞的线粒体和溶酶体(×1200)Note. NIRF is the fluorescence of compound NIRG excited in tumor cells. Green is the lysosome-specific probe. Orange is the mitochondrion-specific probe and DAPI is the nuclear probe.Figure 2 NIRG specifically clusters in mitochondria and lysosomes of liver cancer cells(×1200)

2.4 NIRG介导的靶向药物对肝癌PDX模型的治疗效果

三例肝癌PDX模型成瘤后，分组在7、14、21和28 d注射NIRG溶液，F3代裸鼠皮下移植瘤，腹腔注射NIRG溶液后，24 h进行NIRF活体成像均可以检测到肿瘤部位有特异性荧光，确认了NIRG染料在肝癌PDX模型中的肿瘤靶向性，活体成像结果见图5。该化合物能够在肿瘤部位特异性聚集，诱导较强的近红外荧光。连续注射NIRG化合物后能够显著抑制肿瘤的生长(图6)，在三种肝癌PDX移植模型中均显示出治疗效果，说明该化合物兼具荧光成像和肿瘤靶向转运化疗药物的能力。

图3 肝癌PDX模型瘤组织的病理形态(×400)Figure 3 Histopathological analysis of PDX models of liver cancer(×400)

3 讨论

吉西他滨是一种脱氧胞苷类似物，具有广泛的抗肿瘤活性，但其非特异性生物分布往往会引起严重的不良副反应[9]。常规化疗药物无肿瘤靶向性，无法将治疗剂特异性递送至肿瘤组织。配有荧光基团的分子前体药物已经成为监测药物输送和释放过程的有用工具。它允许实时监测治疗效果和减少药物剂量，避免潜在副作用[10]。已报道七甲川菁染料主要通过缺氧和活化的HIF1α/OATPs信号识别肿瘤细胞，由于HIF1α和OATPs在大部分肿瘤细胞中普遍高表达，因此该类染料具有了肿瘤靶向性，在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等肿瘤中均有报道其肿瘤成像的靶向性[5-8,10-12]。Shi等[13]尝试将抗肿瘤药物氮芥与近红外荧光染料IR-780碘化物结合，构建了新的靶向药物IR-780NM，该化合物兼具有肿瘤靶向性和近红外荧光成像能力。将七甲川菁化合物IR-783与单胺氧化酶小分子抑制剂氯吉灵共轭结合后，形成了新的肿瘤靶向药物，该化合物能将化疗药物特异性转运至人前列腺癌裸鼠移植模型肿瘤部位，有效抑制肿瘤的生长[14]。

常规化疗药物很难通过血脑屏障(BBB)和血肿屏障(BTB)[15]，七甲川菁染料作为药物载体，与化学治疗药物共价结合后，促进药物穿透血液肿瘤屏障(BTB)，有效抑制脑肿瘤的发生和转移，延长荷瘤小鼠的存活时间[7]。本研究中我们选择临床三例肝癌手术标本，成功制备了PDX模型，通过组织病理学分析确认了移植瘤与原发瘤的相似性，所有移植瘤均保持了AFP的高表达。进一步检测发现PDX肿瘤标本中HIF1α和OATPs的高表达，与七甲川菁染料识别肿瘤细胞的机制相吻合。因此，为了提高化疗药物的肿瘤靶向性，我们尝试将IR-783与吉西他滨(gemcitabine)共轭结合成为IR-783-gemcitabine(NIRG)。该化合物在肝癌PDX裸鼠的移植模型中，能够通过近红外荧光成像显示肿瘤的发生，符合七甲川菁染料的肿瘤靶向性近红外荧光特征并且可以显著抑制肿瘤的生长，显示出良好的肿瘤靶向特异性和成像特性。

注：裸鼠移植瘤和病人原发瘤中AFP高表达；PDX移植瘤中HIF1α和OATP均高表达。图4 肝癌PDX模型瘤组织的免疫组织化学分析(×400)Note. AFP was highly expressed in both nude mouse-transplanted tumors and primary tumors; both HIF1α and OATP were highly expressed in PDX tumors.Figure 4 Immunohistochemical analysis of PDX models of liver cancer(×400)

注：三个PDX移植瘤部位均检测到特异性近红外荧光。图5 肝癌PDX模型的NIRF活体成像Note. Specific near-infrared fluorescence was detected in all three PDX xenografts.Figure 5 NIRF live imaging of PDX models of liver cancer

注：NIRG均显著抑制三种肝癌PDX移植瘤的生长(n=5)。图6 NIRG化合物对肝癌PDX模型的治疗效果Note. NIRG significantly inhibits the growth of the three types of liver cancer PDX xenografts (n=5).Figure 6 The therapeutic effect of NIRG on PDX models of liver cancer

总之，新型七甲川菁染料衍生物-药物缀合物NIRG是检测和治疗人类肝肿瘤的有效制剂。本研究结果为NIR染料的临床应用和未来发展都提供了重要的实验依据。这样的共轭结合物不仅具备了近红外荧光成像的特性，在未来的抗癌治疗中可能成为重要的备选药物。