免疫系统是执行免疫监视、防御及调控功能的重要系统，能识别并清除发生异常的细胞，而恶性肿瘤有免疫抑制、免疫逃逸、无限增殖及转移的能力。免疫治疗通过人为刺激和改造免疫系统，提高肿瘤特异性免疫反应并生成记忆免疫细胞，实现持久的肿瘤消退和可能的治愈。目前已成功研发多种肿瘤免疫疗法并实现了临床应用，包括外源性细胞因子［1］，肿瘤单克隆抗体如曲妥珠单抗、利妥昔单抗及贝伐珠单抗［2］，各种免疫检查点抑制分子的抗体疗法［3］，治疗性疫苗如树突状细胞（dendritic cells，DCs）疫苗，以及利用慢病毒或逆转录病毒载体改造自体或异体淋巴细胞的过继免疫治疗［4-6］，这些方法取得了一定的疗效。

体外转录信使RNA（in vitrotranscription messen⁃ger RNA，IVT mRNA）起初因其高免疫原性、低稳定性和生产制备的局限性，被认为是一种不适合的基因疗法。近年来随着mRNA合成、化学修饰mRNA和递送技术的发展，mRNA稳定性和翻译效率大幅提高，免疫原性逐步可控［7］，其在肿瘤免疫治疗领域显示了巨大的商业价值。mRNA药物与其他生物治疗药物相比存在较多优势：1）mRNA易在体外生产和纯化，除去蛋白药物及病毒载体制备的复杂过程，同时可避免宿主蛋白及病毒源性污染；2）IVT mRNA的生产工艺通用性强，可以快速应用于生产不同的目的蛋白，节省药物研发时间，提高效率；3）mRNA仅需进入细胞质即可翻译成蛋白质，无需进入细胞核，因此不存在基因的插入和整合，提高药物的安全性；4）通过调节序列修饰和递送载体可以改变其半衰期；5）临床试验发现，虽然mRNA的蛋白质表达是短暂性的，但其对于肿瘤的免疫治疗应用有效，且有利于药代动力学和剂量的控制［8-9］。mRNA的肿瘤免疫疗法受到越来越多研究者的青睐，其临床研究迈上了新的台阶，增加了研究者开发更有效的免疫治疗策略的信心。

1 IVT mRNA的合成、纯化及修饰

IVT mRNA在体外通常以包含启动子、5'非翻译区（untranslated region，UTR）、基因编码序列开放读框（open reading frame，ORF）和3'UTR的线性DNA（如线性pDNA、PCR产物）为模板，以4种核苷酸和人工合成的帽子类似物（如m7GpppG、m27，3'-OGpppG）为原料，利用噬菌体RNA聚合酶（T7或SP6）转录出包含帽子的RNA，然后用DNA酶降解模板DNA，再利用多聚腺苷酸聚合酶以腺苷酸为原料合成PolyA尾巴，最后进行分离和纯化。通常mRNA的生产过程会生成一些双链RNA的副产物，这种与病毒基因组和复制中间产物类似的产物是一个潜在的病原体相关分子（pathogen-associated molecule，PAM），能被Toll样受体3（Toll-like receptors，TLRs）识别，产生应激反应。此外，单链RNA分子本身也是一种PAM，能被TLR7和TLR8识别，TLRs的激活会引起炎症，最终导致mRNA的降解和翻译抑制。在制备过程中对mRNA进行纯化，可以减少双链mRNA的产生，减少细胞的免疫应答［9］。对于实验室研发阶段的少量制备，主要用商业化的纯化试剂盒去除多余的核苷酸、短寡核苷酸、帽子类似物、RNA聚合酶、盐等，对于临床生产需制备大量高纯度的RNA（如清除截断的mRNA、双链RNA），可以使用高效液相色谱法（HPLC）［10］等方法进行纯化。

为提高mRNA稳定性、翻译效率及降低其免疫原性，可采取多种方法对其进行改造和修饰，包括对提高mRNA稳定性和蛋白表达至关重要的5'和3'UTR区域序列的改进和修饰（如采用β-珠蛋白的UTR），ORF密码子的优化（选择与tRNA同源的密码子），使用m27，3'-OGpppG帽子结构，以及控制PolyA尾巴的长度等［9］。尽管截至目前RNA转录修饰方法已超过100种［11］，但mRNA的转录修饰方法较少，主要包括尿嘧啶转变为假尿嘧啶（Ψ）［12］、N1-甲基假尿嘧啶（m1Ψ），腺嘌呤转变为N6-甲基腺苷（m6A）、N1-甲基腺苷（m1A），胞嘧啶转变为5-羟甲基胞嘧啶（hm5C）、尿苷清除（UD）、5-甲氧基尿苷清除等［10，13-14］。研究表明通过引入化学修饰核苷酸可以显著降低固有免疫反应，提高mRNA活性，经过化学修饰和纯化的mRNA在DCs中可明显提高蛋白表达量［15］。但也有研究表明，经过纯化未修饰序列优化的mRNA能够在HeLa细胞中产生比修饰过的mRNA更多的蛋白质［16］。实际应用中无论是采用纯化还是修饰技术，应根据靶细胞的类型采用不同的mRNA合成与生产策略以达到最佳药效。

2 基于mRNA的DCs肿瘤疫苗

DCs是摄取和处理抗原并将抗原呈递给T淋巴细胞的专业抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APCs）。mRNA因其制备简单，具有免疫原性可作为药物本身的佐剂，由mRNA修饰的DCs抗癌疫苗受到广泛的研究。DCs已成为刺激癌症T细胞反应的重要方法，其作用机制主要为肿瘤相关抗原mRNA进入DCs胞质后，翻译成相应的蛋白质，由蛋白水解机制水解为多肽，多肽与DCs的组织主要相容性复合物（major histocompatibility complexes，MHC）Ⅰ或Ⅱ结合呈递至细胞表面，含有相应抗原表位的T细胞识别MHC-多肽，增殖、分化为针对特异多肽的效应细胞，效应细胞通过识别肿瘤细胞MHC-特异性多肽而杀死肿瘤细胞，形成免疫记忆细胞，从而为抵御癌症复发提供保障［17］。

2.1 基于mRNA的肿瘤疫苗抗原

目前用于DCs抗癌疫苗的抗原mRNA可以分为两类。

2.1.1 从肿瘤细胞系或患者自体肿瘤组织提取的总mRNA Mu等［18］采用3种肿瘤细胞系的总mRNA负载DCs疫苗治疗19例雄激素耐受的前列腺癌患者，结果8例患者疾病进展（progressive disease，PD），11例病情稳定（stable disease，SD），13例前列腺癌特异性抗原水平下降。Vik-Mo等［19］在脑胶质瘤的临床研究中证明，采用肿瘤干细胞提取的mRNA负载DCs疫苗使脑胶质瘤患者无进展生存期（progression-free survival，PFS）延长2.9倍。因在总mRNA中含有一小部分肿瘤特异性抗原以及大量的非肿瘤特异性抗原，优点是可能引起较全面的特异性反应，应用范围扩大且能制备个体化的疫苗，缺点是若切取患者自体肿瘤组织，可能会引起身体创伤，且制备复杂，其次因所含抗原复杂，可能含有引起免疫抑制的抗原，降低治疗效果，近年鲜见新的临床进展。

2.1.2 体外人工合成的肿瘤抗原mRNA 包括肿瘤相关抗原或从患者肿瘤组织中经过外显子、基因组测序比对后筛选得到的肿瘤特异性抗原又称新抗原［20］。肿瘤相关抗原在肿瘤组织中过表达，在正常组织中少量表达，包括睾丸癌抗原如人黑色素肿瘤抗原（human melanoma related antigen，MAGE）家族，NY-ESO-1和SSX抗原，分化抗原如MART-1/Melan-A、gp100、酪氨酸酶，Wilms肿瘤因子1（Wilms tumor factor 1，WT1）等［21］。新抗原是由随机体细胞突变产生的不存在于正常细胞中的抗原［22］，与肿瘤相关抗原相比，新抗原可被宿主免疫系统识别为非自体，潜在地增加特异性、效率和安全性［23］，因此是免疫治疗中较有吸引力的靶点。事实上，许多临床前和临床研究均表明新抗原引发的特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）是最有效的肿瘤排斥T细胞群［24-25］。然而，自然情况下，患者体内的新抗原特异性的CTL非常罕见，可能是由于低效的抗原呈递和克隆数量少［26］。因此，有必要通过疫苗的形式增强对新抗原的有效免疫。此种策略的优点是可以规模化制备抗原mRNA，引起明确的特异性反应，缺点是特异性反应范围较窄。目前临床上常用多个抗原mRNA共转导至DCs［27-28］。

2.2 mRNA肿瘤疫苗递送策略

将mRNA导入DCs中是抗癌疫苗制备非常重要的步骤，目前临床上主要有两种方法。

2.2.1 从患者外周血提取DCs 采用巨噬细胞集落刺激因子、白介素-4（interleukin-4，IL-4）或IL-15等刺激DCs分化成熟，电脉冲转染肿瘤抗原基因的mRNA，然后回输至患者体内［27］。此种方法的优势是mRNA转导进入DCs的效率高，在临床试验中被证明安全和有效，但体外培养自体DCs属于个体化生产，价格昂贵，属于劳动密集型，工艺复杂，并且需要高技能的技术人员进行制造，极大地限制其在临床中的广泛应用［29］。尽管如此，目前许多治疗不同类型癌症的临床试验均采用此类方法，取得了良好的临床疗效。

Aarntzen等［30］将gp100及酪氨酸酶的mRNA负载DCs，治疗26例Ⅲ期及19例Ⅳ期黑素瘤患者。Ⅲ期患者中，1例PD，12例持续缓解；Ⅳ期患者中，6例SD，1例部分缓解（partial remission，PR），1例于3次DCs注射后出现PR，手术切除原发病灶后继续行DCs疫苗治疗，结果淋巴结及上颌窦转移病灶持续缩小并最终消失，该患者完全缓解（complete remission，CR）持续52周以上。Wilgenhof等［27-28］通过编码CD40配体、Toll样受体4、CD70、黑色素瘤相关抗原（MAGE-A3、MAGE-C2、tyrosinase或gp100）和人白细胞抗原（HLA）Ⅱ类靶向信号融合蛋白的mRNA负载DCs疫苗（TriMixDC-MEL），在临床Ⅰb期中15例晚期黑色素瘤患者，2例CR，2例PR；在Ⅱ期临床试验中，39例晚期黑色素瘤患者接受TriMixDC-MEL疫苗联合ipilimumab治疗，8例完全反应，7例部分反应，6例SD。Anguille等［31］在临床Ⅱ期试验中，采用编码WT1的mRNA疫苗治疗并预防急性髓系白血病复发，30例患者中白血病复发13例；9例病情缓解中，5例于中位随访109.4个月后持续缓解，4例SD。5年总体生存率（overall survival，OS）应答者高于无应答者，在首次CR中接受DCs的患者中，WT1疫苗诱导的复发率降低了25%。

Khoury等［32］将人端粒逆转录酶及溶酶体靶向序列的mRNA负载DCs，治疗16例首次CR，3例两次CR及2例早期病情复发的急性髓性白血病患者（acute myelogenous leukemia，AML），结果表明58%的CR患者（19例患者中的11例）在最后一次随访时未复发；57%的患者年龄≥60岁（7例中的4例）也被发现在平均随访54个月中无复发。Batich等［33］对剂量加强的替莫唑胺预处理后，行巨细胞病毒抗原（cytomegalovi⁃rus，CMV）-pp65的mRNA负载DCs治疗11例脑胶质瘤患者，临床结果表明极大增强了患者pp65细胞反应，平均PFS 25.3个月，平均总生存期41.1个月，4例患者在确诊后59～64个月仍无PD。Reap等［34］进一步对17例脑胶质瘤患者行随机CMV pp65-特异性T细胞联合CMV pp65的mRNA负载DCs疫苗治疗，或盐水替代CMV pp65的mRNA负载DCs疫苗治疗，结果发现CMV pp65的mRNA负载DCs疫苗可以显著地提高CMV pp65 CD8+T细胞分泌IFNγ+、TNFα+、CCL3+的多功能能力，该结果表明适应性T细胞和DCs疫苗的联合治疗是潜在抗肿瘤疗法，有待进一步研究。

2.2.2 直接原位注射mRNA疫苗 临床应用时，可在患者皮下、淋巴结、瘤内等直接注射裸露的mRNA、鱼精蛋白或纳米颗粒包裹的mRNA［35］。但调控IVT mRNA的翻译效率仍然具有挑战性。裸露mRNA可通过清道夫受体介导的内吞作用被多种细胞自发吸收。因此，仅一小部分mRNA可被APCs捕获并到达细胞质行后续的翻译和抗原呈递。为了使APCs对抗原的捕获最大化，裸露mRNA可以通过皮肤针刺直接进入淋巴结。Sahin等［36］对晚期黑色瘤患者通过淋巴结注射个体化的编码多个新抗原表位的mRNA，所有患者接种疫苗后均产生对应抗原表位的强有力的T免疫反应，尽管淋巴结注射有效且安全，但需要重复注射（最多接种20次），降低了该策略的实用性。但原位直接注射mRNA疫苗目前主要用于治疗或预防感染性疾病［35］，在肿瘤治疗上仍处于研发阶段［37］，临床研究较少，可能是mRNA原位递送效率低，而mRNA在体外导入DCs的效率高，引起的特异性肿瘤反应更高效。

3 基于mRNA的T细胞肿瘤免疫治疗

除了使用mRNA制备肿瘤疫苗，也可以使用编码肿瘤特异性T细胞受体（T cell receptor，TCR）和嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）的mRNA直接改造T细胞，产生肿瘤特异性效应T细胞。TCR-T细胞免疫治疗在黑色素瘤等实体肿瘤的临床试验显示良好的安全性及抗肿瘤效果［38］，CAR-T细胞免疫治疗在B淋巴瘤等血液肿瘤中取得良好的抗肿瘤效果［39］。临床上的TCR-T和CAR-T主要使用病毒载体制备，但病毒载体制备工艺复杂，存在基因整合至T细胞基因组的风险。目前已有一些临床试验采用mRNA替代病毒载体行肿瘤免疫治疗。

Beatty等［40］临床试验中2例患者的自体T淋巴细胞体外电转靶向间皮素抗原的CAR mRNA，其中对转移性胰腺癌患者行静脉注射及瘤内注射，对恶性胸膜间皮瘤患者进行静脉注射，结果证明自体T细胞CAR mRNA过继治疗安全，且能引发广泛的抗肿瘤反应。Svoboda等［41］通过mRNA瞬时表达CD19嵌合受体的CAR-T细胞治疗经典型霍奇金淋巴瘤（cHL），4例患者在1个月的反应评估中，1例CR、1例PR、1例SD、1例PD。在临床前研究中，通过体外电转HBV抗原特异性的TCR mRNA至自体T细胞，治疗肝移植后复发的肝癌患者，结果显示该方案有良好的安全性且患者肿瘤缩小，目前该项研究已获得新加坡临床试验批准［42-43］。因mRNA仅是瞬时表达（经过修饰后目前可持续表达1周［9］），使用mRNA制备的细胞需进行多个批次制备，而每批次均需要进行质量检测，而病毒载体介导的T细胞改造可以每个患者一个批次生产，具有体内扩增和更长的持久性。因此目前基于mRNA的CAR-T、TCR-T免疫治疗主要处于研发阶段及临床前的T细胞靶点安全性、可行性与有效性的筛选。

4 机遇与挑战

近年，随着mRNA技术的发展，mRNA疗法越来越广泛应用于临床研究。早期的mRNA疗法主要专注于传染性疾病治疗［35］，最近越来越多的研究将mRNA疗法应用于肿瘤免疫治疗并取得了积极的疗效［9］。体外电脉冲导入mRNA的DCs疫苗有着良好的发展前景，但在制备和扩增方面存在诸多局限。目前正在研究替代细胞，如B淋巴细胞就是一种颇具潜力的APCs，较DCs有更强增殖能力，且能增加淋巴细胞器官靶向性［44］。另一个策略是使用更易制造的模拟天然APCs功能的合成APCs［45］。同时DCs疫苗特异性抗原及TCR-T、CAR-T治疗靶点的筛选也是一个巨大的挑战［26］，此外需设计构造出生物兼容性新型智能生物递送策略，以实现多个甚至十几个抗原同时原位递送至APCs，引发多种多样的特异性T细胞，发挥肿瘤杀伤作用。虽然mRNA疗法作为发展中的技术，仍有很多问题亟待解决，如需提高其本身在体内外的稳定性，实现大规模生产成本的合理化，提高原位转导效率等，但mRNA在肿瘤免疫治疗领域的应用已经显现良好的前景，其商业化指日可待。