唐雨豪 王骏成 朱应钦 陈锦滨 张耀军 周仲国 陈敏山 徐立

时已为晚期，肝切除与局部消融术的效果有限，需要接受全身性化疗、靶向药物治疗等，上述治疗手段一定程度上可以延长患者的生存时间，但对肝癌患者的预后改善有限［2］，亟需新的肝癌治疗策略。

近年来，随着肿瘤免疫治疗取得一系列突破，肝肝癌在全球最常见的癌症中位居第六位，在癌症相关性死亡中位居第四位。肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）约占原发性肝癌的75%～85%，过去20年里HCC的发病率和死亡率不断增长，是主要的全球健康问题之一［1］。多数肝癌患者就诊癌的免疫治疗也得到越来越多的关注［3］。按照作用机制和免疫治疗可分为主动免疫和被动免疫治疗（获得性免疫治疗），本文就近年来HCC免疫治疗的现状和研究进展进行概述。

1 主动免疫治疗

主动免疫治疗是指通过激活肿瘤患者受抑制的免疫系统，使机体产生获得性免疫力以对抗肿瘤的疗法，目前肝癌的主动免疫治疗主要包括抗原依赖性免疫治疗、非抗原依赖性免疫治疗和细胞因子治疗等。

1.1 抗原依赖性免疫治疗

抗原依赖性免疫治疗一般指肿瘤疫苗治疗，癌症免疫治疗的首要目标是通过激活先天和适应性免疫反应来促进肿瘤的消除，达到治疗肿瘤的目的。目前，有关HCC的肿瘤疫苗主要包括致敏树突状细胞（dendritic cell，DCs）疫苗、多肽疫苗和DNA疫苗。该方法主要采用自体肿瘤细胞或培养的自体肿瘤细胞或异体肿瘤细胞对肿瘤患者进行免疫接种，使患者产生非特异性或抗原特异性免疫反应来发挥抗肿瘤作用。

DCs是人体内功能最强的抗原呈递细胞，并且在主动免疫和过继性免疫中发挥桥梁的作用，是机体免疫反应的始动者，能有效激活初始T细胞，引发机体产生抗肿瘤免疫反应，并通过干扰素-γ（interferon，IFN-γ）的释放抑制肿瘤血管生成［4］。一项Ⅱ期临床试验表明，利用肝癌细胞系HepG2裂解产物刺激DCs并进行过继免疫治疗的进展期肝癌患者中，12.7%患者血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平较治疗前降低，肿瘤体积缩小，且耐受性良好［5］。在另一项研究中［6］，分别用经肝动脉栓塞（transhepatic arterial embolization，TAE）和TAE加DCs疫苗注射20例和13例HCC患者，结果发现联合方法能更有效地增强肿瘤特异性免疫反应。但是在使用DCs疫苗的HCC患者中，仅观察到有限的临床结局改善，两组的肿瘤复发率并无差异，这可能与HCC患者的肝脏免疫抑制环境，以及目前DCs疫苗缺乏特异性HCC靶标抗原相关［7-8］。尽管DCs疫苗制备过程复杂，但DCs疫苗刺激产生的针对肿瘤细胞的免疫应答可能是可行且积极的策略，而且对于肝癌患者是安全可耐受的肿瘤治疗方式，是肝癌术后一项新的辅助治疗方法［9］。

肿瘤相关抗原（tumor associated antigens，TAAs）和肿瘤特异性抗原（tumor specific antigens，TSAs）的发现和确认使多肽疫苗的设计更为合理有效，多肽疫苗可诱导机体产生特异性T细胞，明显促进免疫增强以及肿瘤的消退，目前用于多肽疫苗的TAAs主要包括AFP和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）。最早的HCC多肽疫苗［10］基于AFP特异性的CD8+T细胞表位，外周血检测显示接种受试者产生AFP特异性T细胞应答，但后来的Ⅱ期临床试验仅检测到一过性免疫反应。近期一项Ⅰ期临床试验发现［11］，接受AFP特异性多肽疫苗的15例受试者均未出现不良事件，其中1例受试者肿瘤完全缓解（complete response，CR），8例受试者肿瘤进展减缓。一项GPC3疫苗治疗的Ⅰ期临床试验招募了33例晚期HCC患者［12］，GPC3疫苗相关细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）高表达患者和低表达患者的中位总生存期（median overall survival，mOS）分别为12.2个月和8.5个月。

1.2 非抗原依赖性免疫治疗

免疫检查点是抑制免疫系统激活的重要节点，免疫检查点受体在肿瘤组织中通常表达上调，从而帮助肿瘤逃避宿主的免疫监测。免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）可以阻断肿瘤诱导的免疫抑制状态，从而增强抗肿瘤免疫［13］。在肝癌治疗中，ICIs靶点包括细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4）、程序性死亡受体-1（programmed death-1 receptor，PD-1）及其配体PD-L1等。

1.2.1 CTLA-4抑制剂 CTLA-4仅在活化的T细胞、调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）和幼稚T细胞上表达，可竞争性抑制CD80/86-CD28途径的T细胞激活［14］。CTLA-4抑制剂为最早应用于临床的ICIs，包括ipilimumab和tremelimumab等，前者最早用于黑色素瘤，而tremelimumab是目前唯一应用于HCC治疗的CTLA-4抑制剂，其疗效在两项临床试验中得到了评估：一项Ⅰ期研究［15］纳入20例HCV相关的BCLC-C期HCC患者，tremelimumab治疗的部分反应率（partial response，PR）为17.6%，疾病控制率（disease control rate，DCR）为76.4%，患者6个月和1年生存率分别为64%和43%。值得注意的是，虽然45%患者出现3～4级丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）升高，但是多出现在第1个疗程期间，后续治疗过程中未出现。另外一项Ⅱ期研究观察了在sorafenib耐药的HCC患者（BCLC-C期）中使用tremelimumab联合局部治疗（TACE 和 RFA）的效果［16］，26.3%（5/19）患者可以获得PR，在治疗后第6周的穿刺活检中，这些临床获益的患者肿瘤内CD8+T细胞明显增多。与CTLA-4相关的免疫相关的不良事件（immune-related adverse events，irAEs）主要涉及皮肤和胃肠道，其次是肝脏和内分泌系统。

1.2.2 PD-1/PD-L1抑制剂 PD-1属于CD28超家族，主要表达于CD8+T细胞，也在Treg细胞和骨髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）上有表达，其与配体PD-L1、PD-L2结合而传递T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）的共抑制信号，高水平的PD-1表达可令CD8+T细胞效应功能丧失，并介导Treg细胞的分化和增殖，从而调节外周免疫耐受［17-18］。肿瘤细胞可以通过表达PD-L1或PD-L2来激活PD-L1/PD-1信号传导，从而激活肿瘤浸润淋巴细胞中的PD-1并逃避免疫监视。相关研究表明，肿瘤中PD-1和PD-L1的表达与HCC分期、局部复发率和不良预后显著相关［19-20］。越来越多的临床证据表明，PD-1/PD-L1抑制剂单药治疗是安全、可耐受的，并且在晚期HCC患者中可达10%～20%的客观缓解率（objective response rates，ORRs）［21］。

Nivolumab是一种针对PD-1的人IgG4单克隆抗体，2017年12月获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于既往接受过sorafenib治疗的晚期HCC。在Checkmate 040Ⅰ/Ⅱ临床研究［22］的剂量递增试验（0.1～10 mg/kg）中，nivolumab在治疗晚期HCC中显示出了可控的安全性和可接受的耐受性，仅25%的受试者在该阶段显示3/4级毒性反应（转氨酶、淀粉酶、脂肪酶升高和瘙痒等）。另外，在这一阶段的试验中，nivolumab的ORR为15%，6个月和9个月总生存率均为66%。而在Ⅱ期剂量扩展阶段（3 mg/kg），ORR为20%，6个月和9个月总生存率分别为83%和74%。

Pembrolizumab是一种针对PD-1的人源化IgG4单抗，其临床疗效和安全性与nivolumab相似。一项Ⅱ期临床试验结果表明［23］，在sorafenib治疗失败的晚期HCC患者中，pembrolizumab治疗的ORR为17%，尽管在73%患者中出现了治疗相关的不良反应，但是3、4级毒性反应发生率仅为24%和1%，且并未观察到病毒的再激活或爆发，转氨酶升高也在预期范围内。pembrolizumab也在2018年11月获得FDA批准用于晚期HCC的二线治疗。针对PD-L1的单克隆抗体durvalumab也在sorafenib治疗失败的晚期HCC患者中取得一定疗效：一项纳入39例受试者的Ⅰ/Ⅱ期临床试验显示ORR为10.3%［24］。对于其他针对PD-1/PD-L1的抑制剂，如avelumab、spartalizumab、atezolizumab和camrelizumab等，目前正在开展HCC患者的临床试验。

由于PD-1抑制剂在进展期肝癌患者中已取得一定的临床获益，且安全性良好，而目前对于肝癌根治性切除术后的患者仍缺乏标准辅助治疗方案，PD-1单抗单药或联合应用作为肝癌患者根治性切除或消融术后的辅助治疗的研究也成为研究热点。如nivolumab与安慰剂对照作为辅助治疗高复发风险HCC的全球随机双盲Ⅲ期研究（NCT03383458），toripalimab对比安慰剂用于局部晚期肝细胞癌根治术后辅助治疗的Ⅱ/Ⅲ期研究（CTR20182326），camrelizumab联合阿帕替尼对于肝癌术后患者的Ⅱ期临床研究（NCT03722875）等均已启动并入选患者，有待进一步研究数据披露。

大多数HCC患者对ICIs单药治疗不能获得客观肿瘤反应，部分患者的肿瘤仍会进展或无法获得持久的控制，各国学者均试图通过联合用药方案增强ICIs的疗效。不同作用机制的ICIs联合使用可能会提高患者反应率和抗肿瘤效应，如CTLA-4和PD-1/PD-L1单克隆抗体抑制剂联合，可能令阻断作用相互协同，提高反应率，改善治疗结果［25-26］。在HCC中，tremelimumab和durvalumab的联合使用也初步观察到一定的疗效：反应率为20%（8/40，CR+PR），但不良事件发生率也较单药治疗有所增加（60%≥1级）［27］。

同时，ICIs与靶向药物的联合理论上可能导致更为迅速的肿瘤反应，并可延长缓解时间，在动物实验中已观察到治疗反应率的提高［28-29］。目前，正在进行的靶向药物与ICIs联合治疗进展期肝癌的临床研究多达数十项，包括ICIs与多靶点酪氨酸激酶抑制剂的联合方案nivolumab联合sorafenib（NCT03439891）、pembrolizumab联合regorafenib（NCT03347292）、pembrolizumab联合lenvatinib（NCT03006926）、camrelizumab联合apatinib（NCT03463876）等。此外，ICIs与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth，VEGF）单抗的联合方案nivolumab联合bevacizumab（NCT03434379）、atezolizu mab联合Bevacizumab（NCT）等。以上联合用药方案中，pembrolizumab联合lenvatinib及atezolizumab联合bevaci zumab的早期数据报道客观反应率达到25%以上，不良反应可控，被认为是最有希望的组合［30-31］，相关的Ⅲ期临床研究正在进行中，结果值得期待。

1.3 细胞因子

细胞因子是由免疫细胞及其相关细胞合成分泌的一类低分子蛋白或糖蛋白的大家族，目前用于HCC治疗的细胞因子包括干扰素（interferon，IFN）、白介素（interleukin，IL-2）等，其中关于IFN的研究相对成熟。

IFN分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ，既往多用于治疗病毒性肝炎［32］，研究证实三类IFN均可促进HCC细胞凋亡［33-35］。IFN-α可能改善HCC患者根治性切除术后的预后，IFN-α组与对照组的中位无病生存时间（median disease-free survival，mDFS）分别为31.2个月和17.7个月（P=0.142），mOS分别为63.8个月和38.8个月（P=0.000 3）［36］。IFN-α也可以联合化疗药物，如肝动脉灌注5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）联合皮下注射IFN-α用于合并门脉癌栓的晚期HCC，早期CR率和PR率分别可达3.5%和69.5%［37］。Obi等［38］报道，在IFN-γ和5-FU联合治疗116例伴门静脉侵犯肝癌患者中，19例（16%）患者治疗反应可达到CR，42例（36%）患者可达到PR，总体的6、12和24个月累计生存率分别为53%、34%和18%。但由于IFN对HCC患者的确切疗效与高毒性率的争议，该方案不宜作为可推广的标准治疗方案。有研究发现［39］，低表达miR-26与患者对IFN治疗高反应相关，或可作为是否采用IFN治疗决策的重要依据。

IL-2具有多种生物学功能，在免疫调节中发挥中心作用。IL-2能刺激自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）、T细胞以及淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cell，LAK）的增殖和活性，从而引起抗肿瘤效应。2016年和2017年美国国立综合癌症网络（NCCN）指南推荐高剂量IL-2作为转移性黑色素瘤的二线治疗［40］和Ⅳ期透明细胞为主型肾细胞癌的一线治疗［41］，但高剂量的IL-2在HCC患者中常导致严重的不良反应。低剂量IL-2治疗的耐受性较好，但并无足够的临床试验证明能够有效延缓HCC进展［13］。

2 被动免疫治疗

被动免疫治疗是指给患者输注外源的免疫效应物质以发挥特异性免疫作用治疗肿瘤，相较于主动免疫并不依赖机体免疫系统产生免疫抗体。过继性细胞疗法（adoptive cell therapy，ACT）则是HCC被动免疫治疗的最主要方式，其利用癌症患者自身具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，通过细胞因子刺激、体外培养或行肿瘤抗原负载，使其中具有抗肿瘤活性的免疫细胞大量扩增，再回输至患者体内达到直接杀伤肿瘤细胞的目的。目前，研究较多的ACT包括有细胞因子诱导杀伤细胞（cytokine-induced killer cell，CIK）、嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）、NK细胞、抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）等［42］。

2.1 细胞因子诱导杀伤细胞

CIK是具有不同TCR特异性效应细胞的混合细胞群（包括CD3+CD56+、CD3+CD56-和CD3-CD56+细胞），具有针对肿瘤细胞的非MHC限制的细胞毒活性，能够识别肿瘤抗原并直接杀死癌细胞［43］。研究发现在HCC根治性治疗后使用CIK细胞输注辅助治疗可以达到一定的生存获益：一项Ⅲ期临床研究［44］纳入230例根治性治疗后的HCC患者（手术切除、RFA或经皮乙醇注射术），接受免疫治疗的患者（每次输注6.4×109CIK，接受16次/60周治疗）的中位无复发生存（median recurrence-free survival，mRFS）时间相较未接受免疫治疗的患者更长（44.0个月vs.30.0个月，P=0.010），虽然CIK组患者的不良事件率更高（62%vs.41%，P=0.002），但是两组出现严重不良事件的频率并无显著性差异（P=0.15）。另一项系统性综述［45］分析了7项RCT和9项非RCT临床试验，这些研究中CIK治疗均作为HCC常规治疗（手术治疗、RFA和TACE）后的辅助治疗，结果表明CIK辅助治疗可以明显提高OS，并可降低术后复发率（P＜0.001）。

2.2 CAR-T细胞

CAR-T细胞是目前肿瘤ACT治疗的重要进展和研究热点。CAR-T细胞技术通过整合嵌合抗原基因修饰的T细胞来靶向攻击肿瘤。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptors，CAR）含有单克隆抗体的抗原结合部分和与效应受体信号传导相关的共刺激和信号结构域，可以特异性地识别TAA，进而引起T细胞的激活和增殖［46］。目前，主要的HCC相关CAR抗原包括GPC3、黏蛋白-1（mucin-1，MUC-1）VEGF-A、上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM）以及病毒抗原等。

有研究［47］设计了分别具有CD28和CD137共刺激信号结构域的GPC3-CAR-T细胞，体外试验发现前者有更高的细胞毒性，而后者则可以诱导更明显的CAR-T细胞扩增。基于上述发现，目前一系列验证GPC3-CAR-T的疗效和安全性的临床试验已经展开或正在招募患者。尽管CAR-T细胞疗法的安全性在转移性HCC患者中已经得到初步确认，但可能诱发细胞因子风暴等严重不良反应，CAR-T细胞疗法用于临床治疗HCC还需要更多的临床研究验证。

2.3 NK细胞

NK细胞在针对病毒感染和肿瘤的宿主先天性和适应性免疫防御中起关键作用，可保护肝细胞免受肝炎病毒感染或恶性转化，在癌变早期即能迅速发挥杀瘤效应。Lin等［48］报道经皮冷冻消融联合同种异体NK细胞治疗可显著延长晚期HCC患者的PFS（单纯消融vs.消融联合NK-ACT：7.6个月vs.9.1个月，P=0.011）。为提高NK细胞免疫疗法的特异性和杀伤效率，一些研究对NK细胞进行基因修饰，其中包括利用CAR-T细胞，将CAR过继至NK细胞以提高其免疫效能。相较于CAR-T细胞，CAR-NK细胞因其更短的寿命而降低了自身免疫和肿瘤转化的风险，而其释放的IFN-γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等细胞因子较CAR-T治疗相对安全［49］。

3 小结

免疫治疗是现阶段恶性肿瘤最具前景的治疗策略，在肝癌中免疫治疗已初见曙光，但目前使用的免疫疗法较为单一且临床疗效有限。因此，不同免疫治疗的组合，或与常规治疗的联合策略，如局部介入或消融治疗后与免疫治疗协同增效的模式及方法等将是未来的重点研究方向。综上所述，肝癌的免疫治疗处于快速发展阶段，与肝癌相关新的TSA/TAA、免疫抑制通路等免疫靶点的发现和识别及对HCC免疫微环境的进一步研究，将为肝癌免疫生物治疗带来新的希望。