川牛膝多糖硒酸酯对口蹄疫受免小鼠抗体的影响

2019-01-05何述辉叶淑均黄杨钦

中国畜禽种业 2019年3期

何述辉叶淑均黄杨钦

（重庆市渝北区畜牧水产站 401120）

口蹄疫病毒是我国强制免疫病种，但口蹄疫疫苗在临床上免疫效果并不理想。特殊情况下，严格隔离病畜后用中药治疗早期牛口蹄疫疾病治愈率可达80%左右，获得良好的治疗效果[1]。中药或其有效成分作为免疫增强剂配合疫苗免疫能提高疫苗的免疫效果[2,3]。

1 材料与方法

1.1 主要药品和试剂

川牛膝多糖提取：川牛膝500g、蒸馏水、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇、丙酮。

川牛膝多糖硒酸酯制备：川牛膝多糖粉末、0.5%HNO3、Na2SeO3、BaCl2、碳酸钠、pH试纸、无水硫酸钠、抗坏血酸。

小鼠体外注射试验佐剂：试验小鼠50只、口蹄疫疫苗、铝佐剂、硒酸酯多糖佐剂。

1.2 主要仪器

低速离心机(0412-1型)：上海手术器械厂。

隔水式恒温培养箱（GHP-9160型）：上海齐欣科学仪器有限公司。

酶标仪（Bio-RAD 680型）：美国伯乐生物技术公司。

1.3 试验动物

昆明小白鼠50只，体重18～22g。

1.4 试验方法

川牛膝多糖的提取方法：（1）川牛膝100g研磨碾碎，加入1.2L蒸馏水煮2h，过滤并收集滤液。（2）将滤液放入烧杯中，置于60℃水浴锅中浓缩至100ml即得出提取液。（3）提取液中加入提取液1/4体积的三氯甲烷、1/16体积的正丁醇，震荡5min，在2000r/min条件下离心15min，如此重复5次。（4）加入适量的无水乙醇醇沉，静置过夜，用丙酮、无水乙醇反复洗涤得到沉淀物，置于烘箱中烘干沉重，即可得到多糖。

川牛膝多糖硒酸酯的制备方法：（1）取川牛膝多糖1g，加入5%HNO3及100ml蒸馏水，水浴加热至70℃。（2）分别加入0.8g左右Na2SeO3和1.44gBaCl2在70℃的水浴锅中静置加热6h。（3）6h后取出冷却至室温，过滤，取滤液用无水碳酸钠调节pH=6～7。（4）加入1.4g无水硫酸钠入滤液中，振荡1min，在2000r/min离心，离心15min。（5）离心后去上清液装入透析袋中透析，直到用抗坏血酸检测无红色为止。（6）讲透析后的药品置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h得川牛膝多糖硒酸酯，取出并密封保存。（7）经红外光谱检测，合成成功。

分组及免疫程序：将小鼠随机分为5组，每组10只。试验分为空白组（Naive）、多糖硒酸酯组（SRCPS）、疫苗组(FMDV)、疫苗+多糖硒酸酯组(FMDV+SRCPS)、疫苗+铝佐剂组(FMDV+alum)。所有免疫均采取腹股沟皮下注射进行免疫，空白组(Naive)小鼠注射生理盐水（9%NaCl）200μL，多糖硒酸酯组(SRCPS)小鼠注射川牛膝多糖硒酸酯溶液200μL，疫苗组(FMDV)小鼠注射口蹄疫疫苗200μL，疫苗+多糖硒酸酯组（FMDV+SRCPS）小鼠注射口蹄疫疫苗200μL与川牛膝多糖硒酸酯溶液200μL，疫苗+铝佐剂组(FMDV+alum)小鼠注射口蹄疫疫苗200μL与铝佐剂200μL，14d后进行二免，方法同前。

血清采集及检测：分别将对照组及试验组二免后14d时进行眼眶采血1ml/只血样静置于4℃冰箱过夜，4000r/min，离心10min，分离出血清供检测抗体，将血清分装于0.2ml塑料离心管中，-20℃保存。