张慜晨 综述 高伟成 审校

【提要】 巨噬细胞在创面愈合过程中具有关键作用，通过多种机制参与炎症、增殖和重塑过程。研究表明，巨噬细胞数量、亚型和功能的变化，直接或间接影响着创面的炎症状态和修复重建等生理活动。我们对近年来有关皮肤软组织创面愈合过程中巨噬细胞调控机制研究的相关文献进行回顾综述，以期为创面愈合相关基础和临床研究提供帮助。

创面愈合过程涉及多种细胞和细胞因子。研究发现，巨噬细胞在创面愈合过程中发挥着重要作用，通过多种机制参与炎症、增殖和重塑过程。我们对近年来有关皮肤、软组织创面愈合过程中巨噬细胞调控机制研究的相关文献进行回顾综述，以期为创面愈合相关基础和临床研究提供帮助。

1 创伤愈合与巨噬细胞

创伤后首先到达创面的是中性粒细胞，其在凋亡前可存活约24 h，在杀灭微生物和促进创面愈合的过程中起到了中心性的作用[1]。中性粒细胞通过分泌多种抗菌物质，如活性氧（ROS）、抗菌肽和抗菌蛋白酶等，并借助中性粒细胞胞外杀菌网络（Neutrophil Extracellular Traps，NETs）将其吞噬，从而控制病原体入侵。中性粒细胞释放细胞因子和趋化因子募集单核细胞抵达创面，募集而来的单核细胞分化为巨噬细胞，这些巨噬细胞可在创面持续存在数周[2-4]。研究表明，巨噬细胞是伤口愈合过程的关键调节因子，巨噬细胞扮演着多种角色，以确保伤口的正常愈合。巨噬细胞在血管形成过程中也发挥着极为重要的作用，巨噬细胞将自身定位在新生血管附近，帮助其稳定和融合[5-6]。在最后重塑的开始阶段，巨噬细胞释放基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）分解临时的细胞外基质，然后使皮肤成熟到原始的无损伤状态[7]。巨噬细胞在创面的愈合中扮演了两种角色：促进炎性反应的（经典活化）和抑制炎性反应的（替代性活化）巨噬细胞，分别是M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞[8-9]。

2 巨噬细胞分型

2.1 促炎性M1型巨噬细胞

促炎性的巨噬细胞主要为M1型巨噬细胞。M1型巨噬细胞主要由病原菌和Th1类促炎性因子如TNF、IFN等激活，吞噬细胞碎片、吞噬病原菌，释放促炎性细胞因子。M1型巨噬细胞不仅产生一氧化氮、ROS、IL-6、IL-1、TNF-α， 并分泌MMP-2和MMP-9降解细胞外基质，为炎性细胞的浸润提供合适的微环境[10]。

2.2 抗炎性M2型巨噬细胞

抗炎性的巨噬细胞主要为M2型巨噬细胞。相比于M1型巨噬细胞，M2型巨噬细胞主要由Th2类因子，如IL-4、IL-13等激活，活化的M2型巨噬细胞发挥抗炎性反应，以促进创面愈合，并且释放一系列抑制炎症反应的细胞因子（如IL-10、TGF-β1等）。这些细胞因子可以诱导巨噬细胞产生精氨酸酶-1从而抑制iNOS的激活，拮抗M1型巨噬细胞发挥促炎性作用，随着组织开始修复，成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞迁移和增殖，有利于创面的愈合和重塑，最终形成瘢痕。M2型巨噬细胞在促进创面愈合时，分泌高水平的生长因子，如 PDGF、胰岛素样生长因子-1、VEGF、TGF-β1 等，有助于细胞增殖、肉芽组织形成和血管生成[7，10]。同时，也产生金属蛋白酶抑制剂-1，拮抗MMPs，有助于细胞外基质的形成。M2型巨噬细胞在促重塑阶段，通过上调IL-10的表达来抑制炎性反应，主要表达精氨酸-1、抵抗素样分子-α（Resistin-Like Molecule-α，RELMα）、 程序性死亡配体（Programmed Death Ligand 2，PDL2）和 TGF-β1等。促重塑阶段的 M2型巨噬细胞的功能是恢复组织的稳态和平衡，通过抑制肌成纤维细胞的凋亡、T细胞增殖和恢复平衡的MMP/TIMP水平来减少纤维化。有证据表明，由经典途径激活募集而来的巨噬细胞也能转变成替代性途径活化的巨噬细胞，即M1型巨噬细胞可以转变成M2型巨噬细胞[11]。

3 皮肤巨噬细胞的起源

皮肤巨噬细胞有两种不同的来源[12]：①出生前形成的常住巨噬细胞群体；②循环单核细胞被招募到损伤区域而分化成巨噬细胞。第一类细胞由胚胎卵黄囊产生的自我更新细胞组成。这些细胞被称为真皮巨噬细胞，常住在健康的成人皮肤中，经常出现在附近的皮肤附件中。在皮肤受损后，骨髓来源的单核细胞被招募到皮肤中，局部分化为巨噬细胞，在伤口愈合中发挥关键作用，这就是第二类巨噬细胞[7]。

真皮巨噬细胞位于毛囊附近、周围结缔组织鞘内，有助于调节毛发的生长周期，巨噬细胞在毛发生长过程中的活动之一是吞噬胶原蛋白，以允许基质重构。Castellana等[13]在小鼠模型中发现皮肤驻留巨噬细胞凋亡可激活上皮毛囊干细胞，促进毛发再生。巨噬细胞特异性wnt信号被证明是这一过程的中心。抑制后，毛囊生长延迟。巨噬细胞的凋亡发生在毛囊由休眠期向发育期过渡之前。这些研究强调了真皮巨噬细胞在毛发生长中的重要性。虽然有更多的研究将巨噬细胞与毛囊联系起来，而不是汗腺或皮脂腺。但仍有证据表明，巨噬细胞也能对这些附属腺体所创造的微环境进行反应。例如，皮脂腺细胞产生的脂质会影响局部巨噬细胞是否具有促炎性或抗炎特性，这可能会阻碍或促进该区域的愈合[14]。在损伤过程中，驻留在组织中的巨噬细胞可作为损伤或入侵病原体的早期指标。其中一些巨噬细胞表达CD4，位于毛细血管附近[12]，通过识别损伤相关的分子模式和释放过氧化氢，启动强大的促炎级联反应[15]。在感染情况下，驻留在组织中的巨噬细胞识别病原体相关的分子模式，以帮助对抗早期感染。

真皮巨噬细胞启动的局部炎症反应较为短暂，在小鼠实验中发现单核细胞来源的巨噬细胞在损伤后24 h被招募，以增强炎症反应，保护组织免受进一步损伤[15-16]。单核细胞来源的巨噬细胞最初通过损伤相关的分子模式（Damage Associated Molecular Patterns，DAMPs） 或病原相关分子模式（Pathogen Associated Molecular Patterns，PAMPs） 信号被招募到创面中，如革兰氏阴性菌外膜的脂多糖（LPS）通过与Toll样受体结合而识别PAMP信号，这种信号通路的激活因子NF-kB促进促炎性因子基因的表达。细胞死亡后，细胞外的DNA、RNA、ATP被释放，启动DAMPs信号通路，使炎性细胞到达创面。单核细胞也可通过炎性因子和下游的DAMPs或PAMPs细胞因子招募到伤口表面，如IL-1、IL-6、TNF-α等。除了上述的募集机制，还发现单核细胞可通过受损的血管募集到创面发挥作用[15，17]。

4 皮肤创伤后巨噬细胞的募集

单核细胞可分为促炎型（M1）和抗炎型（M2），前者来源于骨髓和脾脏，损伤后血液CD14+CD16-（人）或Ly6C+/high（小鼠）的浓度升高[6，18]。表面细胞黏附分子将这些细胞从循环系统招募到血管壁。当没有损伤时，促炎单核细胞不会紧密黏附。但是，当存在损伤时，在伤口附近局部存在炎症趋化因子和细胞因子，如 CCL2（MCP-1）、TNF-α 和 IFN-γ 等，这些趋化因子或细胞因子促进细胞黏附分子的表达，有助于促炎性单核细胞的募集，并且促进其与内皮细胞的牢固黏附并随后转移到组织空间中发挥促炎性作用。

另一种被募集的类型是抗炎性（M2）巨噬细胞，人类标志物CD14low/-CD16+，小鼠则为Ly6-/low。这些细胞通过整合素（LFA-1）和 L-选择素（CD62L）附着在血管壁上，CD62L 的表达使抗炎性单核细胞即使在稳态时也能在内皮细胞上附着，可在需要时就近协助组织和血管的修复，促进愈合[6，18，19]。

这些不同的巨噬细胞也有一些共同的特征，对于处于创面愈合早期和晚期的促伤口愈合性巨噬细胞来说尤其如此。因此，这些巨噬细胞在创面愈合中的作用是由M1型和M2型巨噬细胞共同介导完成的，是一个动态变化的过程。

5 巨噬细胞在急性创面中的作用

研究表明，创面中巨噬细胞的耗竭会导致小鼠再上皮化延迟，胶原蛋白的形成减少，阻碍新生血管的生成[20-21]。这些效应随着TNF-α水平的升高而发生，并逐渐降低VEGF和TGF-β1的水平。此外，在没有巨噬细胞的情况下，中性粒细胞存在时间延长，影响伤口收缩[20]。

虽然巨噬细胞在创面愈合过程中的作用至关重要，但目前对其了解仍不足，各表型的作用及其在创面愈合不同阶段的比例也知之甚少。Mirza等[21]分别在创伤后5、10、20 d分离创面愈合过程中的巨噬细胞，研究其表型和作用。他们发现，在野生型小鼠中，促炎性的巨噬细胞在第5天被检测到，这些巨噬细胞高表达IL-1β、MMP-9和NOS。第10天时，这些促炎性因子表达下降，而抗炎性的标记物CD206、CD36和IGF-1、TGF-β、VEGF 等表达增加。 Evans等[22]使用人体急性创伤模型，以更好地理解水疱中巨噬细胞由促炎向抗炎作用的转变。应用斑蝥素化学诱导伤口，伤后16 h和40 h收集水疱液，分别代表创面愈合的炎症期和消退期。与16 h相比，40 h时液体中产生更多的单核细胞/巨噬细胞。此外，CD163+巨噬细胞的比例在后期增加了10倍以上（3.4%vs.47.6%），表明CD163与愈合的消退阶段密切相关。伤口液体中炎症介质的数量也有一定的变化。在16 h“炎症”时间点，CCL2、CXCL8水平明显升高。在40 h“重塑”时间点，创面液中巨噬细胞来源的趋化因子和TGF-β明显增多。有趣的是，这项研究报告了IL-10在任何时间点都检测不到其水平，这是令人惊讶的，因为IL-10被认为是一种由抗炎巨噬细胞产生的高水平细胞因子。

6 巨噬细胞在慢性创面中的作用

当巨噬细胞失调时会造成创面愈合的多种并发症，如形成慢性创面或过度增生的瘢痕组织[7]。慢性创伤中的巨噬细胞对已死亡的嗜中性粒细胞的吞噬能力降低，从而积累和促进强炎症环境。糖尿病患者由于高血糖和晚期糖基化终产物，使巨噬细胞吞噬凋亡细胞的活性下降，巨噬细胞清除中性粒细胞的行为可诱导M1型巨噬细胞向M2b表型转换，导致炎症消退[23-25]。这就是为什么慢性伤口可能有大量M1巨噬细胞的原因之一。

糖尿病的特点是伴有细胞因子和生长因子分泌的慢性炎症，糖尿病可引发微血管基膜增厚，导致炎性细胞黏附在微血管内膜上，创面局部抗感染能力下降。局部血液供应的减少并伴随着静脉血管回流功能的下降，使创面局部缺血缺氧，创面愈合进程不能按照有序的生物学步骤进行，继发不愈。糖尿病创面常被作为研究慢性难愈合性创面的模型。一种被广泛用于伤口愈合研究的糖尿病动物模型是db/db小鼠。db/db小鼠是由瘦素受体基因突变导致的肥胖、糖尿病和血脂异常的遗传模型。有文献证明，db/db小鼠创面明显延迟愈合。在巨噬细胞功能方面，Khanna等[25]的研究表明，db/db小鼠创面处巨噬细胞的胞外功能降低，导致创面细胞凋亡负担和炎症谱增加。对创面巨噬细胞的研究表明，与野生型小鼠相比，糖尿病小鼠的巨噬细胞功能没有得到适当的调节，M1巨噬细胞的存在时间延长，从而导致向M2表型过渡效率低下。Mirza等[21]发现，非糖尿病小鼠伤口的巨噬细胞在第10天已经从促炎症表型转变为抗炎表型，但是糖尿病小鼠的巨噬细胞仍保留着促炎症特征。到创伤后第20天，糖尿病小鼠的巨噬细胞仍保留着促炎症特征，而非糖尿病创面已经完成了从M1型到M2型巨噬细胞的表型转变。总的来说，糖尿病和非糖尿病创面巨噬细胞在第10天才开始表现出明显不同的细胞因子或生长因子差异，而在第5天时有相似的水平。这表明，在第5天至第10天之间，非糖尿病小鼠伤口正按照M1向M2样巨噬细胞表型的变化过渡到增殖阶段，而糖尿病小鼠伤口在持续的促炎巨噬细胞的引导下仍然表现为高度炎症。总之，这项研究提供了糖尿病小鼠巨噬细胞表型转化延迟与伤口愈合延迟的关键证据。但是，Yan等[26]的研究显示，M1型巨噬细胞长期存在并不是导致伤口愈合中断的唯一原因。另外，有研究表明，如果M2型巨噬细胞存在太久，可能会形成过多的胶原蛋白，最终形成瘢痕[7，27]。这些研究表明，巨噬细胞过多或长期存在，无论其表型如何，都可能导致伤口愈合的相关并发症，巨噬细胞在创面中的动态变化及平衡机制还有待进一步研究。

7 与巨噬细胞有关的治疗措施

根据不同类型巨噬细胞在创面愈合反应中的作用，推测抑制M1巨噬细胞表型和促进M2样表型的干预手段可能有助于慢性创伤的愈合，亦存在应用外源性巨噬细胞治疗慢性创伤的可能。

7.1 抑制内源性的M1型巨噬细胞

Goren等[28]试图中和ob/ob小鼠伤口中的M1巨噬细胞，于小鼠受伤后第7天全身性给予抗TNF-α或抗F4/80抗体直至炎症期结束。这些治疗导致伤口愈合和再上皮化，而用非特异性抗体治疗的对照组伤口仍未愈合。在应用抗TNF-α或抗F4/80抗体组的小鼠中，创面的巨噬细胞总数减少且TNF-α、IL-1β和CCL2表达水平降低，与对照组相比，巨噬细胞凋亡数目增加。抗TNF-α和抗F4/80治疗，降低了M1巨噬细胞对创面的影响，加速了糖尿病创面愈合。值得注意的是，该研究选择损伤后第7天作为开始治疗的时间点，M1型巨噬细胞介导的早期炎症反应并未被阻断，而治疗时机的选择似乎没有影响到M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，M2型巨噬细胞正常发挥促进创面愈合的作用。

7.2 补充外源性M2型巨噬细胞

自发现M2型巨噬细胞和创面愈合过程息息相关，就有研究试图直接分离M2型巨噬细胞并补充到创面中，以促进创面的愈合。然而，Jetten等[29]将分化成M2a和M2c表型的巨噬细胞注射到小鼠创面中，并没有加速野生型小鼠的创面愈合，甚至延迟了糖尿病小鼠的创面愈合。在早期炎症反应（损伤后1～3 d）时，M2巨噬细胞被引入创面，并在损伤后15 d继续表达M2标志物。该研究结果可能是由于治疗时机的选择不对，干扰了M1型巨噬细胞的功能，而在炎症阶段甚至创面修复初始阶段需要一定量和一定功能的M1型巨噬细胞。这项研究提示，可能需要选择一个适当的治疗时间节点，以达到M1和M2型巨噬细胞的动态平衡。

8 展望

综上所述，巨噬细胞在皮肤软组织创伤愈合中发挥着重要作用，M2型巨噬细胞的主要功能为促进创面愈合，但过多、过久聚集停留在创面会产生瘢痕组织。关于单核细胞募集和巨噬细胞分化的细节仍然存在疑问，特别是单核细胞是否注定会成为一种特定的表型（M1/M2型），或者巨噬细胞本身是否会在组织内从M1变为M2表型，以及M1和M2型巨噬细胞在创面愈合中发挥作用的时间节点等，仍有待今后进一步的深入研究。