李卫，孟庆刚，杨琪，曲志伟，毕佳琦，成勇，林琛，李宝林，刘锐

（哈尔滨市第一医院 手外科，黑龙江 哈尔滨 150001）

手部外伤后瘢痕组织严重影响患肢的功能，治疗效果往往不佳，而声动力疗法一直是近年来研究热点[1]。我们前期研究结果已表明，DVDMS-SDT效应对增生性瘢痕成纤维细胞有毒杀作用。本实验通过各种实验方法为DVDMS-SDT效应抗人瘢痕研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 实验细胞复苏培养与生长

取人增生性瘢痕组织(离体后4 h内)，将所得标本用生理盐水漂洗数次，去除上皮部分，切成2 mm×2 mm大小的组织块，送入无菌培养瓶中，按一定间距平铺，向瓶中加入少量培养液。将组织块铺于瓶底培养，细胞经3～4次传代培养后处于对数生长期(取第5代之内的细胞用于本实验研究)，待细胞70%～80%融合时用于实验。取对数生长期细胞，以每孔5×105个细胞、200μL培养液分别均匀接种于96孔培养板中[2]。每种实验条件均设3复孔。所有人员签署知情同意书并经哈尔滨市第一医院伦理委员会批准。

1.2 实验分组及DVDMS-SDT作用

分为对照组（C组）、单纯超声组（U组）、单纯华卟啉钠药物组（DVDMS组）、华卟啉钠声动力组（DVDMS-SDT）。超声辐照仪：天使牌，美国斯坦福大学超声波实验室联合北京（中美）天使科技有限公司产品。治疗参数：超声频率1.0 MHz(兆赫)，超声声强0.8 W/cm2，超声辐照时间120 s，每日1次。向培养皿中注射DVDMS（2μg/mL），华卟啉钠由青龙高科技股份有限公司研制，规格10 mg/瓶，l，3 h后进行超声辐照，超声探头在水中与瘢痕相距1.0 cm[2]。

1.3 MTT法检测细胞增殖能力

实验分组如下（每组3 mL细胞悬液）：C组、U组、DVDMS组、DVDMS-SDT组。超声辐射条件同上，超声辐射后，用台酚蓝立刻进行细胞计数，调整幸存的人增生性瘢痕成纤维细胞密度至1×105个细胞/mL，分别接种于96孔板，200μL/孔，每组种5复孔，置于37℃，5%CO2饱和湿度孵箱内继续培养。分别于12，24，36，48h各取一块96孔板加MTT20μL/孔，继续培养4h，小心吸掉上清液，加入DMSO每孔200μL振荡10 min，用自动酶标仪检测在490 nm波长下各孔OD值。本实验重复3次。将预处理的细胞接种于96孔培养板中，根据试剂盒依次加入MTT20μL/孔，继续培养4 h，弃去培养基，加入溶解液，振荡摇匀，酶联免疫检测仪测定，计算，本实验重复3次。

1.4 流式细胞仪检测细胞内线粒体跨膜电位

实验分为四组（每组3 mL细胞悬液），DVDMS浓度：2μg/mL（于超声辐照前4 h加入），超声辐照前3.5 h加入罗丹明123（10μg/mL）0.5 mL。超声辐照条件：0.80 W/cm2×120 s。超声辐照后，将四组细胞分别转入50 mL培养瓶中继续培养。3 h后收集细胞，参照文献方法，PBS洗2次去血清，37℃避光孵育30 min，PBS漂洗2次，加入0.5 mL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测，激发波长为488 nm。

1.5 流式细胞仪检测细胞内活性氧水平

取对数生长期的人增生性瘢痕成纤维细胞，常规处理后，DVDMS浓度：2μg/mL（于超声辐照前4 h加入），超声辐照前3.5 h，加入DCFH-DA 10μmoL/L的，加入的体积以能充分盖住细胞为宜，方法同上检测。

1.6 流式细胞仪检测细胞内钙离子水平

取对数生长期的人增生性瘢痕成纤维细胞，常规处理后，超声辐照前3.5 h加 Fluo-3-Am 5μL（10μmol/L），置二氧化碳培养箱中孵育，其间轻微振荡3次，方法同上，检测超声辐照条件同上。超声辐照后，辐照3 h后收集细胞，离心去掉多余染料，再用无钙缓冲液反复洗涤3次，最后用无钙缓冲液稀释至1 mL，于流式细胞仪检测，激发波长488 nm。

1.7 萤光显微镜观察（Hoechst33258染色法）

取对数生长期细胞，常规处理后，以每孔1 mL接种在24孔板内。24 h后取有细胞生长良好且均匀的血盖片，超声辐照条件同上。超声辐照后，将细胞爬片置于培养箱中继续培养。6 h后取出细胞爬片，用PBS洗2次去血清，加入1 mL的4%甲醛溶液，4℃固定细胞10 min，用PBS洗2次，滴加 Hoechst 33258染液100μL，室温染色10 min，蒸馏水冲净晾干，以紫外光波长激发，荧光显微镜下观察。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 DVDMS-SDT作用对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

DVDMS-SDT作用对人增生性瘢痕成纤维细胞生长的影响结果见表1，从表1可见，DVDMS-SDT组光密度值明显较同一时间点C组、DVDMS组、U组低（P＜0.01）。而DVDMS对人增生性瘢痕成纤维细胞的生长无明显抑制作用。

2.2 DVDMS-SDT作用对人增生性瘢痕成纤维细胞线粒体跨膜电位的影响

本实验用罗丹明123作为荧光探针测定人增生性瘢痕成纤维细胞内的线粒体跨膜电位。从流式细胞仪分析结果图中可清楚地看到两个峰值，表明人增生性瘢痕成纤维细胞内线粒体跨膜电位的减少只发生在部分细胞中，因而该结果以百分比表示较为科学。三组细胞线粒体跨膜电位降低的百分比分别为：C 组(7.76±1.63)%，DVDMS 组（10.74±0.72）%，U组(20.45±4.76)%，DVDMS-SDT 组(54.36±9.13)%，可见DVDMS-SDT组线粒体跨膜电位均明显下降，与C组、DVDMS组、U组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 DVDMS-SDT作用对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

2.3 DVDMS-SDT作用对人增生性瘢痕成纤维细胞内活性氧水平的影响

本实验用DCFH-DA染料孵育后流式细胞仪检测，DCF的荧光强度增高的细胞百分比分别为：C组(1.87±0.67)%、DVDMS 组 （7.01±1.73%），U 组(28.73±2.87)%、DVDMS-SDT 组(70.93±2.76%)，可见后两组活性氧水平明显高于对照组（P＜0.01），尤其以DVDMS-SDT最为显著，与C组、DVDMS组、U组比较，其差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 DVDMS-SDT作用对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子水平的影响

本实验用 Fluo-3-Am染料孵育后流式细胞仪检测，Fluo-3与钙离子集合后荧光强度增高的细胞百分比分别为：C组(1.32±0.35)%、DVDMS组（2.76±1.39%）、U 组 (32.67 ±1.09%)、DVDMS-SDT 组(60.67±4.32%)，可见后两组钙离子水平明显高于对照组（P＜0.01），尤其以DVDMS-SDT组最为显著，与C组、DVDMS组、U组比较，其差异具有统计学意义（P＜0.01）（图 1-4）。

2.5 萤光显微镜观察人增生性瘢痕成纤维细胞核的变化

细胞核的变化是细胞坏死和凋亡的主要标志，C组：人增生性瘢痕成纤维细胞核清晰可见，染色均匀，边界清楚，大小不一，形状不一。DVDMS组：人增生性瘢痕成纤维细胞形态结构与对照组比较无明显改变，细胞核染色均匀，轮廓清楚，偶见细胞轻微肿胀。SDT组和U组都有细胞损伤，SDT组细胞的损伤程度明显大于单纯超声作用，部分细胞核染色质浓缩，染色加深,核体积缩小，即核浓缩。U组：其细胞损伤的数量和程度明显低于DVDMS组，部分人增生性瘢痕成纤维细胞出现核浓缩。

图1 -4 DVDMS-SDT效应对人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子的影响

3 讨论

增生性瘢痕是皮肤损伤后组织异常修复的一种病理现象，其高发生率严重影响患者的生活质量，目前尚缺乏有效的治疗方法。我们前期研究发现DVDMS-SDT疗法用于治疗兔增生性瘢痕具有显著的疗效，能够显著引起增生性瘢痕中成纤维细胞的凋亡。人增生性瘢痕目前现有的手段治疗效果均不理想，因而一直是临床研究的热点[4]，因此我应用DVDMS作为声敏剂，探讨从细胞增殖状况观察DVDMS-SDT效应对人增生性瘢痕成纤维细胞的迟发抑制作用，并初步探讨其作用机制，为增生性瘢痕治疗提供新的手段。

本实验MTT检测结果证实单纯超声作用后人增生性瘢痕成纤维细胞增殖代谢活性下降，而在DVDMS存在时，人增生性瘢痕成纤维细胞增殖代谢活性下降更明显，但DVDMS对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖活性无明显影响。提示本实验条件下SDT作用降低了人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖代谢活性。由于 MTT法检测反映的是活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的活性，故本实验结果亦表明SDT作用后人增生性瘢痕成纤维细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的代谢活性降低。在DVDMS-SDT治疗过程中，声敏剂经超声辐照后产生的 ROS是诱导肿瘤细胞死亡的一大原因，众多研究表明细胞内 ROS所致的氧化应激可以诱导细胞凋亡[5]。活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的产生是声动力治疗（SDT）杀伤细胞的主要机制。超声通过作用于细胞内的水相环境引起声空化效应，通过激活增敏剂产生大量的ROS，从而直接介导细胞毒性作用。在细胞中产生活性氧分子ROS，如超氧阴离子等自由基。当细胞在内外环境的刺激后，ROS产生增多，从而破坏了机体氧化和抗氧化系统之间的平衡，最终导致氧化应激。本实验应用DCFH-DA染料检测了SDT作用后人增生性瘢痕成纤维细胞内ROS水平的变化。本实验流式细胞仪分析结果表明，在单纯超声辐照后人增生性瘢痕成纤维细胞内ROS水平有所增加，而在DVDMS-SDT作用后 ROS增加更明显，提示在该过程中有 ROS的参与。细胞内的ROS成分是诱导人增生性瘢痕成纤维细胞坏死与凋亡的主要因素[6]。在SDT作用过程中，DVDMS受超声辐照后可能首先产生氧自由基，而后这些基团与细胞的某些物质发生反应，产生新的ROS继续损伤细胞。在体内、外实验证明，阻止线粒体通透性的改变可以防止细胞凋亡。本实验采用罗丹明123来检测细胞内线粒体跨膜电位的变化，提示SDT作用对人增生性瘢痕成纤维细胞的线粒体损伤较重，说明在SDT诱导后人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的过程中，线粒体发挥了重要作用。因此，可以认为在本实验条件下，SDT作用后线粒体内ROS的蓄积所造成的线粒体氧化应激导致线粒体膜通透性转运孔开放，线粒体膜通透性增加及跨膜电位下降可能是SDT作用诱导人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡和死亡的重要机制。钙稳态失衡也是细胞凋亡的重要机制之一[6]，本实验显示DVDMS-SDT同样增高了人增生性瘢痕成纤维细胞内钙离子，与C组、DVDMS组、U组相比，统计学差异显著。

综上所述，SDT对人增生性瘢痕成纤维细胞有迟发抑制作用，我们认为，超声一方面通过超声的机械作用可能直接破坏细胞，特别是膜结构，另一方面通过空化效应激活 DVDMS后产生一系列的自由基，钙离子浓度增高，线粒体膜电位的改变而且相互作用，从而抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和诱导细胞凋亡。