■张学雯 孙镱钊 刘 泽 王晓芳 李 牧 李红亚 李术娜*

（1.河北农业大学生命科学学院，河北保定071001；2.保定市畜牧工作站，河北保定071051；3.河北省畜牧兽医研究所，河北保定071000；4.保定市动物产品检验监测中心，河北保定071051）

玉米芯是玉米穗脱粒后的穗轴，是玉米的副产物，产量巨大，达每年4 000万吨[1-2]。玉米芯具有韧性好、组织均匀、硬度适宜等优点，是一种良好的可回收利用的资源[3]。玉米芯含有粗蛋白质2.42%、粗脂肪0.36%、粗纤维35.42%、钙0.120 1%、磷0.039 9%、中性洗涤纤维79.13%、酸性洗涤纤维42.49%、酸性洗涤木质素5.77%，无毒性且营养丰富[4]。目前对玉米芯的应用研究较少，只有极少部分用于糠醛及木糖醇等生产[5]。玉米芯的适口性较差，营养物质不易消化吸收，致使其在畜牧业中应用较少，大部分被直接烧掉，造成资源的极大浪费同时造成环境污染[6]。因此，利用微生物制剂来提高玉米芯饲用价值的研究具有极其重要的意义。

在养殖业中，发酵饲料作为一种新型环保饲料，已成为当今热点研究方向。利用微生物产生的酶降解农作物副产物中的大分子物质及抗营养因子，改善其消化性能，并提高其粗蛋白含量，同时积累丰富的维生素、矿物质和其他生物活性物质，既可有效提高农副产品营养价值，提高抗病能力，减少疾病的发生，又可以部分地解决环境污染问题[7-8]。已有大量研究证明将其添加于饲料中，可有效提高畜禽的生长率[9-10]。

关于发酵菌剂的研究中，目前，由于单一微生物发酵具有局限性，发酵方式已从单一菌种的发酵趋向于复合菌株的协同发酵。此外，固态发酵本身成本低，可利用资源丰富，对环境污染小，现已成为能源开发的新途径[11-12]。本研究旨在研制适于玉米芯发酵的微生物菌剂，达到提高营养价值和抗病能力，提高饲料利用率，降低养殖成本的目的，为今后合理利用玉米芯提供科学的方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌源样品

河北农业大学生命科学学院制药工程系提供的550株产芽孢细菌。

1.1.2 培养基

纤维素酶鉴别培养基，木质素酶系鉴别培养基，淀粉酶鉴别培养基，蛋白酶鉴别培养基，无机氮培养基，BM培养基，NB培养基，LB培养基[13]。复筛发酵培养基：大豆蛋白胨20.0 g，玉米粉20.0 g，Na2HPO42.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.2 g，水1 000 ml，pH值7.0。

1.1.3 玉米芯粉

将供试的玉米芯机械粉碎为直径约为1.5 mm。

1.1.4 试验动物

肉兔：河北农业大学标本园养殖基地购买60只日龄为8周龄的肉兔并随机分为5组。早中晚3次饲喂肉兔，保持水槽内水量充足，干净卫生。预饲期3 d，饲喂期30 d。肉兔饲料：购于河北省禽塔集团。对照组：饲喂全价饲料。试验1～4组在全价饲料的基础上分别添加10%、15%、20%、25%玉米芯发酵饲料。基础日粮组成及营养水平见表1。

1.2 玉米芯发酵功能菌株的分离

1.2.1 大肠杆菌拮抗菌株的筛选

将3 ml大肠杆菌菌液加入到冷却至45℃左右的NA培养基中，摇匀，倒平板，制成病原菌指示平板。将供试菌株点接于该平板，37℃培养24 h后观察并记录抑菌圈的直径大小。将具有较高抑菌活性的菌株挑选出来重新编号，进行下一步研究。

1.2.2 产酶菌株的筛选

将供试菌株用画十字的方法分别接种于纤维素酶、木质素酶系（避光培养）、蛋白酶和淀粉酶的鉴别培养基的平板上，37℃恒温培养，纤维素酶、木质素酶系、蛋白酶的鉴别培养基平板每天观察菌落周围是否有透明圈；淀粉酶鉴别培养基的平板培养2 d待长出明显菌落后，在平板上滴加碘液，观察菌落周围是否出现的透明圈，记录透明圈的直径大小。挑选透明圈、变色圈较大的菌株进行纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶[14]和木质素酶系活力的测定[15]。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2.3 无机氮转化利用菌株的筛选

将供试菌株种子液以5%接种量接种于无机氮培养基中，37℃摇床培养24 h，测定各菌株培养基的OD600值。

1.2.4 各功能菌株之间的拮抗性试验

将复筛得到功能菌株分别为指示菌，将其种子液接种于冷却至45℃左右的NA培养基中，混匀后倒平板，待平板凝固后点接另外两株细菌菌株，于37℃恒温培养24 h后观察各菌株周围抑菌圈的大小。

1.3 功能菌株的种属鉴定

参考《常见细菌系统鉴定手册》[16]的方法进行菌体、菌落形态观察及生理生化鉴定。依据文献[17]进行菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系统发育树构建。

1.4 玉米芯的发酵效果考察

将筛选得到的3个功能菌株ZX-2、ZX-19、XW-7进行菌液制备，然后按照生物量1∶3∶3的比例复配为复合菌剂对玉米芯进行固态发酵，结束后测定玉米芯中粗蛋白、淀粉、粗脂肪、糖类、粗纤维等营养成分的含量变化来评判发酵效果。粗纤维、粗蛋白、淀粉、粗脂肪、及中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量测定分别依据GB/T 6434—2006、GB/T 20194—2006、GB/T 20194—2006、GB/T 6433—2006及Van Soest等[18-22]方法进行。

1.5 肉兔饲喂效果

记录肉兔始末的体重和给料量，计算肉兔平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和料重比（F/G）。

1.6 数据统计分析

利用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析，进行多重比较。结果以“平均值±标准差”的形式表示。P＜0.05，表示差异显著。

2 结果

2.1 玉米芯发酵功能菌株的分离2.1.1 大肠杆菌拮抗菌株的分离

采用抑菌圈法，共筛选到对大肠杆菌抑菌活性较高的20株菌，结果见表2。

表2 菌株抑菌圈直径大小

至此，从供筛选的菌株中，挑选出菌株ZX-2，具备拮抗大肠杆菌，转化利用无机氮功能，纤维素酶活力为20.58 U/g，蛋白酶活力为58.36 U/g，淀粉酶活力为35.92 U/g；挑选出菌株ZX-9，具备拮抗大肠杆菌，转化利用无机氮功能，产纤维素酶活力为26.74 U/g，木质素酶系活力为48.92 U/g，蛋白酶活力为32.26 U/g；挑选出菌株XW-7，具备拮抗大肠杆菌，转化利用无机氮功能，产纤维素酶活力为54.71 U/g，木质素酶系活力为26.62 U/g，淀粉酶活力为29.61 U/g。将此3种菌株复配为复合菌剂，既可达到试验所设定的全部功能，因此，对此3株菌进行后续试验。

2.1.2 产酶菌株筛选

将筛选得到的大肠杆菌拮抗细菌在各种产酶鉴别培养基上进行筛选，获得了相应地水解圈、变色圈菌株。对水解圈、变色圈较大菌株进行液体发酵，其上清液进行酶活力定量测定，结果见表3。

2.1.3 转化利用无机氮菌株的筛选

通过对菌株进行无机氮利用能力的测定，可以看出有些菌株能够利用无机氮氮源转化成本身菌体蛋白，即成为了有机氮形式。结果见表4。

表3 复筛菌株的各种酶活力大小（U/g）

表4 菌株在无机氮培养基中的生长情况

2.1.4 功能菌株的鉴定

结合菌落和菌体形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鉴定菌株ZX-2为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株ZX-9为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株XW-7为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。菌种的鉴定结果表明三菌株均属于农业部文件规定的饲用允许菌种，安全性以及生产特性良好，可以作为下一步试验的目标菌株。

2.1.5 功能菌株之间拮抗性试验

采用抑菌圈法，测定各功能菌株之间的拮抗性，通过观察透明圈的大小测定菌株间拮抗性的大小。结果表明三株功能菌株之间没有明显的拮抗性。

2.2 玉米芯发酵前后营养成分对比

以ZX-2∶ZX-9∶XW-7=1∶3∶3的接菌比例对玉米芯进行固态发酵后，其营养成分含量较发酵前有了很大变化，表5可见，粗蛋白提高了115.8%，淀粉降低了34.4%，还原糖提高了91.7%，粗纤维降低了21.4%，中性洗涤纤维降低了18.8%，酸性洗涤纤维降低了22.5%。

表5 玉米芯发酵前后营养成分对比

2.3 肉兔饲喂效果研究

表6可见，与对照组相比，试验1～4组日增重分别增长 11.54%（P＜0.05）、17.91%（P＜0.01）、13.21%（P＜0.05）和0.57%（P＜0.05），料重比分别降低了6.21%（P＞0.05）、10.05%（P＜0.01）、8.02%（P＜0.05）和-1.31%（P＜0.05）。试验结果表明当玉米芯添加量为15%时能使试验动物生长性能达到最佳。

表6 试兔生长性能变化

3 讨论

多项研究表明，可以通过微生物对玉米芯进行降解，提高玉米芯饲用价值，从而使玉米芯获得更有效的应用。刘东波等[23]采用毛霉Sb-27、黑曲霉Sb-11固体培养所产生的纤维素酶和木聚糖酶对玉米芯进行酶解，以提高其饲用价值。张飞伟等[5]利用热带假丝酵母发酵玉米芯水解液生产木糖醇，提高了玉米芯商业生产的潜力。

玉米芯是一种可开发利用于草食家畜的非常规饲料资源。近几年来，玉米芯的用途随着养殖业的发展正逐步由废弃物拓展为家畜饲料。家畜对纤维饲料资源利用的研究已逐渐引起人们的关注，田刚等[24]试验发现，用玉米芯和菜籽粕混合物替代苜蓿草粉饲喂肉兔，证实了玉米芯的饲粮中添加一定水平的玉米芯和菜籽粕混合物不会对肉兔生长性能和健康状况造成明显的负面影响。王利华[25]将玉米芯添加于肉牛日粮组合中，结果表明试验牛日增重提高29.48%，经济效益非常可观。石俭[13]将发酵玉米芯添加到獭兔和肉鸭饲粮中，结果表明，试验獭兔日增重提高9.13%，试验肉鸭日增重提高51.27%。

本实验应用的玉米芯饲料由于其适口性好、营养价值高，可大大提高家兔对纤维饲料的利用率，对充分利用粗饲料资源将极具生产实践意义。

4 结论

由试验结果可得，以ZX-2∶ZX-9∶XW-7=1∶3∶3的接菌比例对玉米芯进行固态发酵后，其营养成分含量较发酵前有了很大提高，粗蛋白提高了115.8%，淀粉降低了34.4%，还原糖提高了91.7%，粗纤维降低了21.4%，中性洗涤纤维降低了18.8%，酸性洗涤纤维降低了22.5%。将发酵后的玉米芯以15%的添加量添加于兔日粮中，效果最好，试验2组比对照组的日增重增加了17.91%，料重比降低了10.05%。本试验将添加发酵菌剂的玉米芯饲料应用于肉兔养殖中，可提高肉兔的生长性能。