庞丹丹，张芬，张亚真，韦康，王丽鸳，成浩

中国农业科学院茶叶研究所，国家茶树改良中心，农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江 杭州 310008

茶是世界三大无酒精饮料之一。茶叶中含有大量具有保健功能的多酚类物质，其中花青素是茶树次生代谢途径产生的类黄酮化合物，有助于人类抗氧化消除自由基[1]、预防心脑血管疾病[2]及癌症[3]、降低神经退行性疾病的患病风险[4]。相关研究显示，花青素的大量积累可导致茶树新梢芽叶呈现紫红色，说明茶树花青素的生物合成与紫红色芽叶的形成密切相关[5]。芽叶红紫化是茶树中较为常见的现象，红紫色芽叶一般可分为两种类型，一是普通茶树品种受外界环境因素的影响，如高温、强光等，芽叶由绿色变为红紫色[6]；二是特异茶树品种的新梢常年呈现红紫色[5]，如紫娟、紫嫣等。鉴于花青素的诸多功效，茶树花青素相关的研究显得尤为重要。本文主要阐述了茶树花青素的种类、生物合成、生理功能以及影响茶树花青素生物合成的其他内外因素等，以期为茶树花青素的开发利用提供理论基础。

1 茶树中花青素的种类

花青素（Anthocyanidin）属于类黄酮化合物，是植物体内较为重要的一类次生代谢物，广泛分布于表皮细胞的液泡中[7]，而花青素的积累能使植物呈现不同的颜色。自然状态下，花青素主要以花色苷的形式存在，即通过形成糖苷键的方式与1个或多个葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等结合[8]。目前对于紫化芽叶成分的研究已开展较多，已知的花青素有20多种，“紫娟”中花青苷类主要是飞燕草-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷，其相对含量约为33%和41%[9]；“紫嫣”的花色素苷成分主要是矢车菊色素、飞燕草色素和天竺葵色素的糖苷等，约占鲜重的0.09%[10]。总体而言，茶树紫化芽叶中花青素主要有天竺葵色素、矢车菊色素和飞燕草色素及其糖苷[11]。普通茶叶中花青素含量约占干物重的0.01%，而紫芽茶中可高达 0.5%～1.0%[12]。花青素的稳定性与所处环境的pH存在一定的联系，研究表明在酸性条件下花青素较稳定，其他外部因素相同的条件下，尽可能低的pH可使花青素的降解减慢，从而使得其保存时间延长[13]。另外，在酸性条件下，茶叶中花白素和由儿茶素聚合形成的原花色素也能够部分转化为花青素。

2 茶树花青素的生物合成与转运

2.1 生物合成途径

花青素的生物合成是植物类黄酮物质合成途径的1个主要分支，茶树中花青素生物合成途径的主要步骤已基本探明，主要分为 3个阶段（图1）。首先，苯丙氨酸是花青素合成途径的前体物质，在苯丙氨酸裂解酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）、肉桂酸羟化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和 4-香豆酰 CoA连接酶（4-coumarate CoA ligase，4CL）作用下合成 4-香豆酰 CoA。之后，以香豆酰 CoA为底物，在查尔酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）、查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI）和黄烷酮-3-羟化酶（Flavanone 3-hydroxylase，F3H）作用下生成二氢黄酮醇。其中 CHS是编码植物类黄酮物质生物合成途径关键酶的结构基因，它通过对香豆酰CoA和丙二酰CoA分子的缩合，来催化类黄酮骨架四羟基查尔酮的形成，查尔酮的形成为许多类黄酮提供了前体物质，其中包括黄酮、黄酮醇、原花色素（缩合单宁）异黄酮和花青素；CHI催化查尔酮立体异构化为有生物学活性的相应的黄烷酮，CHI最初被认为是植物界特有的结构[14]，但最近在真菌和原核生物中也相继被发现[15]，由于查尔酮在组织中可被 CHI快速异构化，因此，它在植物体内的大量积累是比较罕见的。F3H可催化黄烷酮C环的羟基化生成二氢黄烷酮，同时F3'H和 F3'5'H也可将黄烷酮作为底物，分别在 B环的 3'位、3'和 5'位上引入羟基。之后，DFR则可利用二氢黄酮醇，二氢杨梅素，二氢槲皮醇或二氢槲皮素其中的任何1种或全部3种作为底物，形成相应的无色花色素，为花青素生物合成提供网格结构。最终，无色花青素在花青素合成酶（ANS）和尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UFGT）作用下形成稳定的花色苷，随后经过各种修饰被转运至液泡中储存。另外，茶树中无色花青素可在无色花青素还原酶（LAR）的作用下形成儿茶素，花青素则可在花青素还原酶（ANR）作用下催化形成表儿茶素，继而生成酯型儿茶素[16]。

通常花青素合成过程中会在其某些位置进行甲基化、酰基化或糖基化修饰，从而形成特异性结构。例如，在叶、花中的甲基化类黄酮含量较高[17]。在花色素中添加糖基可使相应的光谱最大值发生适度的蓝移[18]。目前研究最多的糖基化是通过 UFGT/3GT添加葡萄糖基团，并已从许多植物物种中鉴定得到了UFGT/3GT酶。除了葡萄糖之外，在不同的植物中发现在5'、3'和7'位置含有鼠李糖和其他糖的花青素。除了糖基化作用之外，花青素可以通过花青素酰基转移酶被各种有机酸酰化[19]，酰化有助于分子间堆积，以提高花青素的稳定性和水溶性[20]。

图1 茶树花青素生物合成途径Fig. 1 Biosynthetic pathway of anthocyanins in tea plant

2.2 花青素的转运

黄酮类化合物主要在植物细胞质内质网表面合成[21]，之后被转运到不同的位置，其中花青素及原花青素被运输到液泡中大量积累。花青素合成后的转运过程较复杂，涉及多种转运蛋白之间的互作。其中，谷胱甘肽转移酶（GSTs）是植物类黄酮物质转运过程的关键酶，大量研究发现，植物细胞质中GSTs可与花青素、黄酮醇等多种类黄酮化合物紧密结合[22-23]，以确保花青素在细胞质中的结构稳定性，同时便于液泡膜上转运蛋白的识别，使其转运至液泡中。其中GSTF是与类黄酮物质积累相关研究发现最多的家族，其可能直接作为配体蛋白，与类黄酮结合，参与花青素、原花青素的转运[24]。

目前对于茶叶中花青素合成后转入液泡这一问题的相关研究，相对于模式植物，茶叶中还鲜有报道。Zhao等[25]指出转运花青素进入液泡内的多种膜蛋白，如ABC转运蛋白、MATE转运蛋白等都需要GST的参与。在多种植物上都发现GST基因的缺失或表达量下降会显著减少花青素的含量，并进一步影响到植物的代谢与生长发育[26-28]。例如拟南芥tt19（属于GST基因）同时负责花青素和无色花青素的转运，而矮牵牛花AN9（属于GST基因）仅负责花青素转运。将矮牵牛花AN9基因转入拟南芥tt19突变体，可以提高花青素的含量[26]。在茶树中，张亚真等[29]通过对不同茶树品种正常光照和遮阴处理下的转录组分析，发现CsGST24基因的表达量随着芽叶的发育显著下降，且与拟南芥中负责转运花青素和原花青素的AtGSTF12基因高度相似，推测CsGST24基因可能与茶树中花青素的转运有关，从而造成花青素的积累。Wei等[30]对 F1群体的 6个绿色或紫色茶树的新梢芽叶进行转录组分析，研究发现相对于绿芽茶树，紫色茶树芽叶个体中花青素转运相关的晚期生物合成基因GST（4.6倍）、3GT（3.2倍和 2.1倍）、ANS（1.6倍）等表达量相对较高，推测茶树中花青素的积累也可能通过激活晚期生物合成基因和花青素转运相关基因来完成。茶树中花青素合成后的转运是如何进行的，GSTs在花青素累积中的可能存在的具体作用机制还需进一步的研究。

3 茶树花青素生物合成的调控机制

花青素的生物合成受到内部和外部因素的共同调控。合成途径中的结构基因编码的酶确定了最终生成花青素的种类，转录因子则影响花青素生物合成的强度和表达模式，并且同一调节基因通常能够控制多种不同结构基因的表达；环境因子能够调控花青素生物合成途径中的结构基因，同时还可调控调节基因的表达，从而影响茶树芽叶中花青素的积累[31]。

3.1 花青素生物合成相关的调节基因

转录因子MYB、bHLH和WD40蛋白的复合物在多个物种中介导花青素生物合成的多个酶促步骤[32-33]，MBW复合物通过与花青素生物合成结构基因的启动子结合，从而达到激活相关结构基因表达的功能[34]。bHLH转录因子（玉米R/B家族、矮牵牛AN1和JAF13蛋白）与R2R3-MYB蛋白（玉米C1、矮牵牛AN2）可激活矮牵牛和大多数其他双子叶植物中部分花青素生物合成基因[35]。研究表明，在玉米中bHLH和R2R3-MYB相互结合有两个作用：一是稳定蛋白质或通过两者之间的相互作用激活转录，二是增强在几个花青素生物合成基因中相对保守的顺式调控元件启动子的活性[36]。Gonzales等[33]研究发现拟南芥MYB75（PAP1），MYB90（PAP2），MYB113和 MYB114转录因子可调控拟南芥花青素生物合成基因F3'H，DFR，ANS和UFGT的表达，这些MYB转录因子是WD40和bHLH依赖性的，其中任何1种在野生型植株中过表达都可导致花青素的大量积累。在茶树中，Wei等[30]对F1群体的6个绿色或紫色茶树的新梢芽叶进行转录组分析，确定了28个差异表达的转录因子，其中CsMYB75基因与拟南芥中调控花青素合成的AtPAP1高度相似。Jiang等[37]运用不同的转录组数据库筛选获得至少140个R2R3-MYB转录因子，其中CsMYB5a和CsMYB5e过表达会强烈诱导转基因烟草花中的花青素和原花青素生物合成结构基因的表达上调，但CsMYB5a降低了转基因烟草中花青素的含量，促进了原花青素的积累；CsMYB5b过表达的烟草中，NtANR和NtLAR基因上调表达，且黄烷-3-醇的含量升高。He等[38]发现CsMYB6A的表达与AtMYB113最相似，并且在调控花青素合成方面一致，特异性地使得CHS和花青素3-O-葡糖糖基转移酶基因（A3T）显著上调表达，从而促进紫色芽叶中类黄酮物质的积累。这些结果表明，茶树花青素合成途径中的靶位点很可能受特定转录因子的调控。同时，有研究提出，MYB基因启动子区域的甲基化能够使得MYB转录因子的功能被激活或缺失[39-41]。Sun等[42]对高花青素茶树品种紫娟的研究发现，CsAN1基因启动子低甲基化水平导致茶树芽叶中花青素的大量累积，初次在营养器官中报道CsAN1启动子甲基化程度与花青素含量存在一定联系。另外，茶树中还存在抑制花青素合成相关的MYB转录因子，Li等[43]通过转录组和代谢分析发现，CsMYB4a基因的表达降低了CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsLAR和CsANR2基因启动子的活性，从而抑制花青素的积累。

除了MYB和bHLH转录因子之外，WD40蛋白，如矮牵牛AN11，拟南芥TTG，玉米PAC1和紫苏 WD蛋白都参与花青素生物合成复杂的调控机制[44]。但bHLH和WD40这两种转录因子在茶树花青素生物合成方面的研究较少。马春雷等[45]利用基因芯片和文库筛选的方式，筛选获得2个明显上调的调节基因MYB和WD40，推测其可能与茶叶中花青素的积累有关。赵磊等[46]从茶树基因组中除了获得多条编码转录因子R3R3-MYB的基因外，还筛选出转录因子bHLH和WD40的编码基因，通过构建进化树发现，后两者可能参与类黄酮物质的合成，但具体的作用机制还需进一步探索。

3.2 影响花青素生物合成的外部因素

环境因子在花青素的积累过程中起着关键作用[47]，茶树花青素的生物合成受到光、温度、氮素和蔗糖等外部因素的影响[31]，它们通过复杂的信号转导网络刺激转录因子，触发与花青素生物合成有关的基因表达，进而造成花青素种类和含量的差异，从而影响茶树芽叶的颜色[48]。

光可以调节花青素合成途径中关键基因的表达[49]。在营养组织中，花青素生物合成的结构基因和调节基因都是受光诱导的，不同光照强度可通过影响花青素合成相关基因的表达来调控植物体内花青素的积累量。对于茶树而言，强光能够诱导花青素合成途径中编码CHS、DFR、ANS和ANR等多个关键酶的结构基因上调表达，使花青素的含量增加；降低光照强度，则抑制基因的表达，使得花青素的积累量减少[50]。花青素合成的调节基因CsAN1、CsGL3、CsEGL在长时间光照条件下的表达量明显高于短光照，这表明长光照有利于MBW复合物相关基因的表达，进而促进花青素的合成[51]。

除光照强度之外，光质对植物花青素的积累也存在重要的调节作用。在苹果、玉米中的研究表明，紫外光是影响花青素积累的主要光质成分[52]。在拟南芥中，研究发现蓝光是通过隐花色素1（cry1）起作用，且cry1参与蓝光诱导花青素合成基因的表达。Chatterjee等[53]将蓝光调控的BnCRY1基因反义转入欧洲油菜中，花青素的合成量明显下降。李智等[50]研究了不同光质对茶树花青素积累的影响，发现花青素合成途径中的结构基因的表达量与紫外光的透射比例呈正相关，紫外光能够上调花青素合成途径中相关基因的表达，提高茶树芽叶中花青素的生成量。张泽岑等[54]研究指出，除紫外光以外，红光、蓝光对于茶树芽叶中花青素的积累的影响也较显著，同时还提出光质对茶叶中花青素生物合成的影响可能不是孤立的。

温度也是花青素生物合成的重要因素，低温能够诱导包括拟南芥和玉米在内的许多物种的花青素合成[55-56]。在茶树中，低温可诱导PAL、CHS、CHI等花青素生物合成相关基因的表达，使花青素含量增加；而高温会造成基因的表达量下调，降低花青素的积累[50]。同时，温度也会影响花青素的稳定性[57]，温度越高花青素的降解速率越快，高温可使酶活性降低甚至失活，合成速率减慢[49]。另外，在茶树CsMYB5e基因过表达的烟草中，NtANS在低温条件下显著上调[37]，这一发现解释了为什么在低温生长时花青素积累。

糖作为信号物质，其信号转导通路会调控一些基因的表达。例如，在蔗糖处理后，拟南芥中花青素生物合成途径的相关基因显著上调，且促进了 mRNA积累，使得花青素的含量显著提高[58]。Weiss等[59]发现在光照条件下，只有在蔗糖和赤霉素同时存在，离体培养的矮牵牛才会着色，发现参与花青素生物合成的大多数结构基因和调节基因都受到蔗糖的调控，例如CHS、CHI、F3H、F3′H、FLS、DFR、LDOX、UFGT、MYB75和PAP1。且相对其他糖类物质，蔗糖能够特异性地调节拟南芥中花青素生物合成的相关基因[58]。

此外，氮素缺乏也可增加植物中花青素的积累量[60-62]。低氮供应显著增加花青素生物合成过程中PAL、CHS、F3'H、F3'5'H、ANS和DFR结构基因的转录水平，同时花青素合成的调节基因PAP1和PAP2的表达量也明显上调[63-64]。在番茄中，氮缺乏引起花青素积累的这种效应是通过 MYB转录因子介导调节的[65]。刘健伟等[66]以高花青素的“紫娟”为材料，发现增加氮素含量能显著抑制茶树新梢和成熟叶中花青素合成基因的表达，这也初步证实氮素调控茶树花青素生物合成的分子机理。

4 花青素的功能

4.1 花青素的生理功能

4.1.1 光保护作用

花青素具有 2个吸收高峰，分别位于270～290 nm紫外光区域和500～550 nm可见光区域，这也就决定了植物中所含的花青素在一定程度上会影响光合作用，因此，推测其具有吸收过滤可见光和紫外光的保护作用。大量研究表明，花青素具有缓解叶片中光氧化损伤的潜力，主要通过屏蔽叶绿体过多的高能量量子和清除活性氧物质[67-68]。Burger等[69]研究发现在受到UV-B和UV-C胁迫时，高花青素的红叶受到的伤害显著低于绿叶，而强可见光处理后，光抑制现象无明显差异，这也在一定程度上证明了花青素在表皮细胞中起到了光保护的作用，但其具体的光保护机制尚不清楚。

4.1.2 渗透调节作用

花青素作为一种水溶性色素，具有渗透调节的作用。在低温胁迫下，植物花青素合成的相关酶活性增加，促使营养器官中积累的碳水化合物转化为花青素，表皮细胞液泡中的花青素使得叶片渗透势降低，降低冰点以减少冻害，从而抵御逆境胁迫[70-71]。在葡萄糖和甘露醇的渗透胁迫下，植物花青素积累量增加[72]。因此，花青素可能直接或间接地参与植物细胞的渗透调节。

4.2 花青素的保健作用

茶树紫色芽叶特异品种中富含的花青素作为一种自由基清除剂，具有抗氧化、预防心血管疾病及癌症、改善视力等多种保健功能。费旭元等[73]对“紫娟”茶的研究表明，其茶叶中富含的花青素具有较强的抗氧化活性。林志诚等[74]指出，紫芽茶的花青素提取物作为化学抑制剂，能够抑制结肠肿瘤细胞的增殖生长，诱导癌细胞的凋亡。国内的1项病例对照研究也显示绿茶或乌龙茶消费量与心血管疾病患病风险呈负相关[75]。梁名志等[76]通过动物降压试验以及茶中相关降压物质的分析，提出特种紫芽茶中富含的花青素可能是降压效果显著的重要物质。

5 展望

花青素作为一种天然色素和抗氧化剂，在医疗、保健、营养价值等方面具有广泛的利用价值和应用前景；同时，花青素对逆境胁迫下的植物具有一定的保护作用。因此，选育特异紫色芽叶茶树品种，开发利用高花青素新产品是目前茶树花青素研究的重要任务。

目前，尽管转录组、基因功能验证等研究为我们提供了大量基础数据，初步了解了茶叶花青素累积的模式，且分离得到花青素生物合成途径相关的大部分的结构基因，但花青素合成的调控基因的研究相对较为欠缺，还不足以揭示其复杂的调控机理。茶树紫色芽叶形成的关键基因究竟是什么，以及外部因素如何与转录因子、结构基因两者进行互作仍需要更多的证据对其加以阐述。花青素与儿茶素处于类黄酮合成途径的不同分支，为什么在紫芽茶中较高的类黄酮合成途径相关基因表达没有导致儿茶素的提高而仅仅提高了花青素？在该合成途径是否有花青素专一性的基因在起作用？对于这些问题尚没有明确答案。此外，花青素在茶树中的其他功能，如抗逆机制、光保护作用等相关研究也较模糊。因此，需进一步借助基因组学、转录组学、蛋白组学及代谢组学等技术手段，进一步挖掘关键的花青素合成调控的相关基因，明确其生物合成的调控机理，为茶树富含花青素的特异品种的开发利用提供理论依据。