徐腾月 任 霞

中国人民解放军食品检测试验中心 北京 101301

沙门菌是最常见的食源性细菌病原体，是食物传播病原菌中研究最多的一种病菌，也是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国各类细菌性的食物中毒中，沙门菌常常位居前列。所以，沙门菌的检测是各个国家检验机构对食品的必检项目之一。

检测食源细菌的传统方法是对目标菌进行培养、分离和生化鉴定，有时还需要进行血清学鉴定，繁琐耗时。因此快速、准确地检验微生物的新技术、新方法不断出现，可提高食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。

通过参加能力验证活动，能够发现实验室存在的问题，帮助实验室不断改善技术和管理水平，同时还能增加客户对实验室的信任程度[1]。

为了提高实验室的检测能力和水平，本实验室参加了由原辽宁出入境检验检疫局组织的沙门菌检测能力验证。此次能力验证样品2个、标准菌株1个、样品4个、样品加标准菌株的菌悬液2个，共9个样品采用国标GB4789.4-2016《食品微生物学检验沙门氏菌检验方法》[2]和3M测试片法，2种方法对测试样品进行检测分析，取得满意结果。

1 材料与方法

1.1 材料

沙门菌样品（冻干粉），由原辽宁出入境检验检疫局提供；鼠伤寒沙门菌 （ATCC 14028）3M测试片，购于北京陆桥技术有限责任公司；4种口味的压缩干粮，由军代室提供。

1.2 培养基和试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂、沙门菌显色培养基、沙门菌干制生化鉴定试剂盒，购于北京陆桥技术有限责任公司。

沙门菌属O多价血清A-F，购于宁波天润生物药业有限公司。

1.3 仪器与设备

BSC-1500ⅡA2-X生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）；AV8101精密天平（美国Spiral Biotech公司）；400VW均质器（法国Interscience公司）；LRH-250生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

2 样品制备

2.1 样品原液的制备

无菌开启西林瓶，立即加入少量（2～4 mL）稀释液（生理盐水）进行再水化，稀释液合计40 mL，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述的无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液，全过程20 min内完成[3]。

2.2 菌悬液的制备

以无菌生理盐水将鼠伤寒沙门菌制成菌悬液，于 36℃±1℃，18～24 h增菌培养后备用。

3 检验方法及结果

采用GB4789.4-2016和3M测试片2种方法进行检测。其中3M测试片只做前增菌的步骤。同时2种方法均利用标准菌株作对照。

3.1 预增菌

（1）以无菌操作吸取水化后的样品原液25 mL，加入装有225mL灭菌BPW的无菌锥形瓶，震荡摇匀。

（2）固体样品粉碎后称取25 g，加入灭菌225 mL BPW的无菌均质袋中，用均质器拍打1～2 min。

（3）20 g粉碎固体样品和5mL菌悬液后加入灭菌225 mL BPW的无菌锥形瓶，用均质器拍打1～2 min。 于 36℃±1℃，培养 8～18 h。

3.2 增菌

取预增菌后的BPW 缓冲液中分别移取1 mL转接种于 10 mL TTB内，于 42℃±1℃培养 18～24 h；移取1 mL转接种于10 mL SC内，于36℃±1℃培养18～24 h。

用无菌吸管吸取1mL能力验证样品、样液和样品加菌悬液的匀液慢慢均匀地滴加到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置10 s左右；同时做菌株的匀液。 于 36℃±1℃，培养 15～24h。

结果：沙门菌在3M测试片上的结果应为绿色菌落。

（1）菌株在3M测试片上的结果为绿色菌落。

（2）能力验证样品1在3M测试片上的结果为黄色菌落。

（3）能力验证样品2在3M测试片上的结果为绿色菌落。

（4）样品1在3M测试片上的结果为黄色菌落。

（5）样品2在3M测试片上的结果为黄色菌落。

（6）样品3在3M测试片上的结果为黄色菌落。

（7）样品4在3M测试片上的结果为黄色菌落。

（8）样品加菌悬液1在3M测试片上的结果为绿色菌落。

（9）样品加菌悬液2在3M测试片上的结果为绿色菌落。

3.3 分离

取增菌后的沙门菌增菌液分别接种在沙门菌显色培养基、XLD琼脂平板于36℃±1℃，培养18～24 h。BS琼脂平板上，于 36℃±1℃，培养 40～48 h。观察各个平板上生长的菌落形态，详见表1。

表1 在不同选择性琼脂平板上的菌落结果

通过观察可以确定沙门菌显色培养基生长的白色和蓝绿色菌落、BS琼脂平板上白色的菌落为非典型菌落，不符合标准菌株的菌落形态可以排除。沙门菌显色培养基上的紫色菌落为A菌，XLD琼脂平板上的能力验证样品1上和样品1～4上为黄色菌落为B菌，黑色菌为C菌，能力验证样品2上的菌落形态是黑色有光泽和黄色为D和E菌，BS琼脂上灰黑色无光泽为F菌，灰绿色带有黑心为G菌，黑色有金属光泽为H菌。一共8种菌落为可疑菌，需进行生化试验和血清学鉴定。

3.4 生化鉴定套装试验结果

（1）分别从沙门菌显色培养基、XLD琼脂平板和BS琼脂平板上挑取A到H共8种菌落及标准菌株分别接种在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基上，于 36℃±1℃，培养 18～24 h，观察结果，详见表2。

表2 沙门菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

通过在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基生化试验比较发现，XLD琼脂平板和BS琼脂平板上的B、C、F 3种菌落生化反应均不符合沙门菌的生化特征，标准菌株符合沙门菌的生化特性。

（2）生化鉴定套装试验：分别从沙门菌显色培养基、XLD琼脂平板和BS琼脂平板上挑取A、D、E、G、H共5种分别接种到沙门菌干制生化鉴定试剂套装中的试剂中，于 36℃±1℃，培养 18～24 h，观察结果详见表3。

表3 生化鉴定结果

通过生化试验比较发现，XLD琼脂平板和BS琼脂平板上的A、D、E、G、H 5种菌落生化反应均符合沙门菌的生化特征，标准菌株符合沙门菌的生化特性。

3.5 血清学鉴定

先检查待测菌有无自凝现象。经检查两种可疑菌均未发生自凝的现象。

在玻片上划出2个约1 cm×2 cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在右边区域加1滴沙门菌属O多价血清A-F，在左边区域加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环将两个区域内的菌落研成乳状液[2]。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑色背景进行观察，可疑菌A、D、E、G、H均发生凝集反应，血清学实验为阳性，B、C、F可疑菌均未发生凝集反应，血清学实验为阴性。标准菌株发生凝集反应，血清学实验为阳性。

4 结论

利用2种方法检测能力验证样品1均未检出沙门菌，能力样品2均检出沙门菌，结果为满意。样品1～4未检出沙门菌、菌悬液加样品1和样品2有效的检出沙门菌。

3M测试片的方法无需特定的仪器设备，且操作简单、快速出结果、灵敏度高、易于判断；该方法已获得AOAC官方方法认证，其结果准确可靠，适合应用于广大食品企业和政府实验室沙门菌的检测[4]。

国标法是经典的检测方法，但检测周期长，过程复杂[5]。3M 测试片方法检测能够快速准确的检测出结果。2种方法结合，综合判断，可确保检测结果的准确性。

通过这次能力验证，提高了实验室的检测能力，积累经验的同时在试验中发现了很多不足：

（1）3M测试片法中由于实验室很少做，因为不知能力验证样品中添加的沙门菌的浓度，直接使用前增菌液，导致测试片上没有单个菌落生长，最好使用增菌后的的液体。或者使用3M测试片法测定沙门菌配套的试剂。

（2）沙门菌分离纯化可疑菌的时候，需要多次纯化，本次实验只挑取了选择琼脂上的可疑菌落，以后实验中出现可疑菌的时候应在营养琼脂纯化后再进行生化试验。

（3）血清学鉴定的时候两种诊断血清都应该做，然而实验室只做了沙门菌属O多价的，盲样未凝集故实验室没做抗原H的鉴定，在以后的试验过程中如果O多价凝集后必须再做抗原H的鉴定。